壳寡糖及双歧杆菌对肿瘤协同抑制实验探究 .docVIP

壳寡糖及双歧杆菌对肿瘤协同抑制实验探究 罗晓庆　钱丽丽　李殿俊　曲丽娟 摘　要：目的：观察壳寡糖协同双歧杆菌对肿瘤抑制作用的影响。方法：采用体内注射的方法将壳寡糖和双歧杆菌注入荷瘤小鼠体内，观察肿瘤生长情况及MTT比色法观察壳寡糖对肿瘤细胞的体外抑制作用。结果：壳寡糖协同双歧杆菌对肿瘤的生长有抑制作用，显微镜观察显示肿瘤组织出现坏死；壳寡糖对肿瘤细胞生长有抑制作用，其抑瘤率与浓度有关，与时间无关，肿瘤细胞经壳寡糖作用后，透射电镜显示细胞有凋亡趋势。结论：壳寡糖协同双歧杆菌可抑制肿瘤生长，同时壳寡糖可能诱导肿瘤细胞凋亡。 关键词：壳寡糖；双歧杆菌；肿瘤；抑制 壳寡糖为壳聚糖的降解物，壳聚糖是甲壳质的脱乙酰化物，甲壳质是虾、蟹等甲壳类、甲虫等的外骨骼及蘑菇等菌类的细胞壁成分，广泛存在于自然界的天然高分子物质，甲壳质和壳聚糖具有广泛的生物学作用，特别是提高机体的免疫功能、抗肿瘤、抗感染等作用，但由于它们不溶于水，其开发利用受到了很大程度的限制，而壳寡糖为壳聚糖的降解物，具有良好的水溶性，易被分散和吸收，而且具有多种生物功能，如作为植物功能调节剂，刺激植物生长，增强植物对病虫害的防御能力。改善动物肠道微生物的区系分布，刺激有益菌的生长，同时它能提高机体的免疫功能和抗癌能力。 双歧杆菌是人类肠道的正常菌群，在体内发挥着生物学屏障作用，除了抗感染、抗突变、促进消化、调节代谢、延缓衰老、抗肠道感染以及控制内毒素血症外，还具有抗移植肿瘤及提高宿主免疫功能的作用。 目前，国内对双歧杆菌抗肿瘤作用的研究开展的很深入，但对壳寡糖抗肿瘤方面的研究报道很少，尤其对二者共同抑瘤作用的研究还未见报道。 1 实验材料 1．1 实验对象 昆明小鼠(哈尔滨医科大学第三临床医院提供)，Hu-人肝癌细胞(哈尔滨医科大学免疫教研室提供)，LH-7人肺癌细胞(哈尔滨医科大学免疫教研室提供)。 1．2药品与试剂 壳寡糖(哈尔滨工业大学提供)，双歧杆菌(哈尔滨工业大学提供)。试剂：小牛血清，1640培养液，四甲基偶氮唑蓝(MIT)，二甲基亚砜(DMSO)。 1．3仪器与器材 倒置显微镜，酶标仪，96孔培养板，超净工作台，二氧化碳孵箱等。 2 方法 2．1体内实验 将120只昆明小鼠随机分为两大组。 2．1．1移植性腹水瘤60只小鼠随机分为6组，每组10只。分别为：双歧杆菌组；壳寡糖小剂量组(0.5％)；壳寡糖大剂量组(1.5％)；壳寡糖小剂量(0.5％)+双歧杆菌组(剂量各半)；壳寡糖大剂量(1.5％)+双歧杆菌组(剂量各半)；对照组(生理盐水)；试验第1天，各组小鼠腹腔种植H22肝癌细胞(1×108/mL)，以后每天向各组小鼠腹腔注射0.2mL的药物或生理盐水。7天后小鼠脱颈处死，无菌取腹水，据腹水量计算抑瘤率。 2．1．2移植性实体瘤分组方法同2．1．1。实验第1-7天各组小鼠腹腔注射药物或生理盐水0.2mL,第8天各组小鼠背部皮下种瘤，同时腹腔继续给药至试验第10天后，小鼠处死剥瘤称重，计算抑瘤率。取实体瘤标本做病理观察。 2．2体外实验 2．2．1 细胞培养L-H7肺癌细胞培养于RPMI-1640培养液(含10％小牛血清)中，在含5％C02的37℃孵箱中培养。细胞呈现贴壁状态，每3天传1代。实验用处于对数生长期的细胞。 2．2．2 MTr法测定壳寡糖对LH-7肺癌细胞杀伤活性调整对数生长期、状态良好的LH-7肺癌细胞数1×104/mL，100μL接种于96孔培养板中。5％C02，37℃孵箱中24h，稳定后，试验组每孔加入壳寡糖80μL，浓度分别为2000、1000、500、250、50mg/mL，均设4个复孔，并且设空白对照，对照组不加壳寡糖，空白组只加培养液。分别作用12、24、48、72h后加入5mg/mL的MIT20μL，孵育4h(细胞在SDH作用下将黄色MTr还原成紫蓝色结晶)后小心弃去上清，加DMS0150μL，振荡(10-20min)均匀，于酶标仪490nm波长处读OD值，重复2次，并计算抑瘤率。细胞生长抑瘤率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。将细胞用戊二醛固定，做电镜观察。 2．2．3透射电子显微镜观察细胞形态学的变化收集各组细胞，用PBS洗过的药物作用48h的LH-7细胞约5×10 6个，置于装有2mL完全培养基的Ependoff管中，1500r/min离心5min，弃去上清，加入2％戊二醛充分吹打细胞，离心，弃去戊二醛，再次加入2mL2％戊二醛固定过夜；1％饿酸固定1h，离心弃去上清，蒸馏水洗2次。2％醋酸铀预染1h，离心弃去上清，蒸馏水洗2次。依次过丙酮逐级脱水，每次5min，树脂包埋，超薄切片，柠檬酸铅染