大黄NFAE6虫丸对肝纤维化大鼠肝组织AT1R及其mRNA表达影响.docVIP

大黄NFAE6虫丸对肝纤维化大鼠肝组织AT1R及其mRNA表达影响关键词 大黄?NFAE6?虫丸 肝纤维化 血管紧张素Ⅱ1型受体 二甲基亚硝胺 大鼠 肝纤维化是各种慢性肝病共同的病理学基础,是诸多慢性肝病向肝硬化甚至肝癌发展的必经阶段,其核心环节是肝星状细胞(HSC)的活化并向肌成纤维样细胞和成纤维细胞的转化,阻断或逆转肝纤维化是治疗各种慢性肝病的关键。肝局部存在肾素血管紧张素系统(RAS),其成分通过血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)可促进肝星状细胞活化从而参与肝纤维化的发展[1]。大黄?NFAE6?虫丸抗肝纤维化治疗疗效确切[2],但其抗肝纤维化作用机制是否与AT1 R有关未见报道。本实验通过观察大黄?NFAE6?虫丸对二甲基亚硝胺(DMN)诱导的肝纤维化模型大鼠的治疗作用,研究其对肝组织AT1 R及其m RNA表达的影响,从RAS角度初步探讨大黄?NFAE6?虫丸抗肝纤维化的作用机制。 1 材料 1.1 动物:清洁级SD大鼠50只,雄性,体重160±20g,由浙江中医药大学实验动物中心提供并饲养。 1.2 主要药物与试剂:大黄?NFAE6?虫丸:3g/袋,湖南回春堂药业有限公司产品(批号;复方鳖甲软肝片:0.5g/片,内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司产品(批号;二甲基亚硝胺:天津市化学试剂公司出品。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)试剂盒均为上海科欣生物技术研究所产品,(批号分别为080101);Trizol试剂:美国Invitrogen公司产品(批号:1382739);AT1R免疫组化试剂盒:河北博海生物工程开发有限公司产品(批号:080713);RT-PCR试剂盒:上海科延生物技术有限公司产品(批号:070602)。 1.3 引物:大鼠AT1 R上游引物:5’-CAC GCT TTC TTA CCG-3’,下游引物:5-TGA CTA CAG GGA CAA CA-3’;β―肌动蛋白(β-actin)上游引物:5ATG CCA TCC TGC GTC TG 3’,下游引物:5GGA CTC ATC GTA CTC CTG CT 3’。引物由上海博尚生物科技有限公司合成。 1.4 实验仪器:组织切片机(德国Leca公司),恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂),PCR循环仪(德国Biometra公司),多功能真彩色细胞图象分析管理系统(美国Media Cybernetics公司),GIS凝胶图像分析处理系统(上海天能科技有限公司)。 2 方法 2.1 肝纤维化模型制备及分组:50只雄性SD大鼠随机分为造模组及正常对照组。除正常对照组大鼠10只外,其余40只大鼠按10mg/kg体重每周一、二、三连续3次腹腔注射1%浓度的DMN进行造模,连续注射4周共12次[3],4周后将存活的35只大鼠随机分为模型对照组12只、大黄?NFAE6?虫丸组12只、阳性对照组(复方鳖甲软肝片)11只。 2.2 实验用药:将大黄?NFAE6?虫丸与复方鳖甲软肝片分别用蒸馏水溶解制成混悬液,按人与大鼠体表面积比折算的等效剂量给药。大黄?NFAE6?虫丸按1.08g/kg体重灌胃给药,复方鳖甲软肝片按1g/kg体重灌胃给药。模型组与正常组以生理盐水10ml/kg体重灌胃,各组均每天给药1次,时间持续2周。 2.3 大鼠处理方法:末次给药当晚禁食不禁水,次日上午空腹按40mg/kg剂量腹腔注射1%的戊巴比妥麻醉,腹腔静脉采血,离心机分离取血清,-20℃冰箱保存备用。迅速分离肝脏,取大鼠肝左叶肝组织入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定,逐级酒精脱水,经透明、常规石蜡包埋,用作肝组织HE染色、苦味酸-天狼红胶原染色及免疫组织化学染色指标的检测。其余新鲜肝脏经生理盐水清洗后立即投入液氮中冻存,3小时后移入-70℃低温冰箱中保存,用于提取总核糖核酸(RNA)及RT-PCR检测。 2.4 检测指标及方法:血清ALT、AST采用赖氏法检测,按试剂盒说明书操作。肝组织行HE和苦味酸-天狼红染色,光镜下观察肝组织病理变化与肝纤维化程度,依照实验动物肝纤维化组织学Ⅵ级标准和改良的Chevallier肝纤维化SSS半定量计分标准进行肝纤维化程度评判。肝组织AT1R的表达采用免疫组织化学SP法检测。逆转录―聚合酶链反应法(RT-PCR法)检测肝组织AT1RmRNA的表达:用Trizol一步法抽提肝组织总RNA,。逆转录后使用上述引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经琼脂糖电泳,GIS凝胶图像分析处理系统对电泳条带进行光密度值扫描,用AT1R/β-actin的光密度比值表示AT1R的mRNA表达的相对水平。 2.5 统计学处理:采用SPSS 13.