大鼠慢性脑低灌注模型再灌注脑组织HIF-1α-VEGF表达意义.docVIP

大鼠慢性脑低灌注模型再灌注脑组织HIF-1α\VEGF表达意义【摘要】 目的 观察缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）在大鼠慢性脑低灌注后再灌注脑组织中表达的意义。方法 SPF级雄性SD大鼠24只，随机分为两组，假手术组（S组）和再灌注组（R组），每组12只。建立大鼠慢性脑缺血模型，6周后恢复血流灌注，于再灌注前即刻（R0）、再灌注1 h（R1）、24 h（R2）及72 h（R3）行激光多普勒血流探测仪（LDPI），检测脑皮层血流灌注量；其后采用qRT-PCR法，检测HIF-1α-mRNA、VEGF-mRNA在脑组织中的表达。结果 大鼠慢性脑缺血再灌注后1 h，实验侧脑皮层血流灌注量较对侧下降（73.12±26.75）%，再灌注后24 h脑皮层血流灌注量有所恢复，72 h仍未达到基线水平；与S组比较，各组大鼠再灌注后的不同时点HIF-1α-mRNA、VEGF-mRNA均表达增高（P25%，提示产生明显的盗血效应，即缺血成功。缺血6周后，腹腔注射10%水合氯醛1 ml/kg，麻醉下恢复血流灌注，采用可控性保温垫维持直肠温37 ℃，维持实验室温度24 ℃～25 ℃，湿度60%。 1.2 脑皮层血流灌注量检测 将麻醉后的大鼠固定于脑立体定位仪上开颅，颅骨窗位于冠状缝和人字缝之间，大小约5 mm×6 mm。于再灌注前即刻（R0）为基础状态、再灌注1 h（R1）、24 h（R2）及72 h（R3）时点，各组随机取6只大鼠，采用PeriScan PIM 3激光多普勒血流灌注成像仪（Perimed公司，瑞典），以低功率激光束连续扫描已暴露的脑窗皮层测量区域和矢状缝中点左右方各1.5 mm点。LDPI激光波长为670 nm，采用NR扫描模式，步长3 mm，扫描头高度在15～30 cm，扫描面积4 cm×4 cm，记录扫描到的面积血流灌注量和目标点血流灌注量。测量数值单位为PU（Perfusion Unit），其值越大代表皮层血流及灌注越强。检测数据及图像直接储存在电脑硬盘，应用LDPI win 3.1软件分析，处理结果导入Excel 2000 用于对比分析［5,6］。 1.3 荧光RT-PCR检测HIF-1α、VEGF-mRNA表达 取各组大鼠右侧半球额顶区皮质，约1 mm×1 mm×2 mm大小。按Trizol试剂说明提取组织总RNA；使用逆转录试剂盒（Promega公司），按操作说明合成cDNA；以cDNA为模板进行PCR扩增。HIF-1α引物：上游5’ tatctgaaagccctggatgg 3’，下游5’ tgggccatttctgtgtgtaa 3’； VEGF 引物：上游5’ gcccatgaagtggtgaagtt 3’，下游5’ actccagggcttcattattg 3’。RT-PCR操作按试剂盒说明进行。PCR条件：95 ℃ 1 min，60 ℃ 1.5 min，72 ℃ 3 min，40个循环后，72 ℃延伸15 min。PCR产物以荧光TaqMan的方法检测，将40个循环所测得基线水平荧光强度的标准偏差的10倍设为CT值（cycle threshold，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数），应用比较Ct法进行相对定量。在RT-PCR的条件下，经过内标基因的均一化处理后，推导出目标基因的相对定量为2-ΔΔCt，即目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。 1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较t检验，P0.05）；R1组可见到实验侧大脑皮层灌注量较对侧下降约（73.12±26.75）%，差异有统计学意义（P0.05）；而R3组的实验侧相比对侧血流下降比率仍为（74.46±27.68）%，差异有统计学意义（P ［2］ Matsuda T ，Abe T， Wu JL， et al.Hypoxia-inducible factor-1 alpha DNA induced angiogenesis in a rat cerebral ischemia model.Neurol Res，2005，27（5）:503-508. ［3］ Zhang ZG，Zhang L，Jing Q，et al.VEGF enhances angiogenesis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain I.J Clin Invest，2000，106：8-29. ［4］ Yassari R， Sayama T，Jahromi BS， et al