巴戟天水提取物对人精子顶体氧化损伤保护作用.docVIP

巴戟天水提取物对人精子顶体氧化损伤保护作用杨　欣　张永华　丁彩飞　颜志中　杜　静 摘　要：目的：观察巴戟天水提取物对人精子顶体结构和功能氧化损伤的保护作用，探讨巴戟天治疗男性不育症的作用机制。方法：采用Percoll梯度离心法选择具有正常生理功能的精子作为精子模型，应用次黄嘌吟－黄嘌呤氧化酶(HX－XO)体系产生活性氧(ROS)，在有氧环境下，ROS、不同剂量的巴戟天水提取物与精子悬液共同孵育后，检测精子顶体完整率，透射电镜观察精子顶体和超微结构，并与已知的抗氧化剂维生素C对照。结果：在ROS作用下，精子的顶体受损，顶体完整率明显下降，与正常者相比差异极显著(P＜0.001)，巴戟天水提取物小、中、大剂量组在相同条件下均可明显减轻ROS对精子顶体所造成的氧化损伤程度，与VitC相比较，0.25和O.5g/mL巴戟天水提取物的作用更明显(P＜0.05，P＜0.01)。结论：适宜剂量的巴戟天水提取物对ROS所致人精子过氧化损伤具有明显干预作用，对精子顶体结构和功能具有保护作用。 关键词：巴戟天；精子；顶体；氧侣损伤 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1423－02 精子顶体缺陷与男性不育有着密切关系。研究表明，活性氧类(Reactive Oxygen Species，ROS)所介导的脂质过氧化作用可引起精子结构与功能改变，是男性不育的一个重要病因。传统中药巴戟天(Morinda officinalisHOW.)具有补肾阳、强筋骨、祛风湿功效，是治疗男性不育症的常用药物。笔者实验研究表明，巴戟天水提取物能显著改善精子运动功能，对精子膜功能具有保护作用。本实验采用体外培养的方法，在有氧环境下，观察巴戟天水提取物对ROS所致人精子顶体结构和功能氧化损伤的保护作用。试图为应用中药巴戟天治疗男性不育症提供实验依据。维生素C是一种水溶性的ROS高效清除剂，还具有还原剂的性质，在细胞内外起着重要的清除氧自由基和抗脂质过氧化作用，因此本实验以其为阳性对照药。 1　材料与方法 1．1　主要仪器和试剂 WLIY－9000伟力彩色精子质量检测系统(配有恒温装置，北京伟力新世纪科技发展有限公司)，2K15C11加热型冷冻高速台式离心机(德国sigma公司)，FOtLMA－3111水套式二氧化碳细胞培养箱(美国热电公司)，JEM－1200EX透射电镜(日本JEOL公司)。 Percon液(Sigma公司，批号：P7828)，10×Earles液(Sigma公司，批号：E7510)，1×Earles液(Sigma公司，批号：E7883)，次黄嘌呤(HX，Sigma公司，批号：X－1882)，黄嘌呤氧化酶(XO，Sigma公司，批号：X－1875)，维生素C(VitC，Sigma公司，批号：A－7506)。90％和45％Percoll液的制备参见文献。 1．2　正常精子模型制备 25－35岁的健康且有生育能力的自愿供精者15名，禁欲3－5天，手淫留取精液于干燥无菌容器，经计算机辅助精子分析(computer－aided sperm analysis，CASA)系统常规分析，精子密度＞60×106/mL，a级精子25％，a+b级精子＞50％，正常形态精子＞60％，WBC＜1×100/mL。采用Percoll梯度离心法制备具有正常生理功能的精子悬液。具体操作如下：在14mL离心管中先加入2mL 90％Per-coil，在其上层轻缓加入2mL 45％Percoil，然后在45％Per-coil的上层轻缓加入2mL已液化的精液；300r/min离心20min；吸去精液层和45％Percoll层，将90％Percoil层与4mL的EarleS液混匀，300f/min离心10min，弃上清，沉淀用适量Earles混悬，并调精子数为20×106/mL。 1．3　药物来源及制备 1．3．1 来源 巴戟天购自浙江省医药公司，经本院杜静主任药师鉴定确认为茜草科植物巴戟天Morinda　officinalisHow的干燥根。 1．3．2　制备由本院制剂室制备。取巴戟天若干加10倍量双蒸水浸泡300min，煎煮30min，滤布过滤，滤渣再加5倍量水同上法再处理2次，各煮沸30和15min，合并3次滤液，用聚乙烯微孔滤管在减压下过滤，除去煎出液中的悬浮粒子，滤液于70－80℃水浴中浓缩至每1mL药液相当于0.5g生药量，冷藏保备用。 1．4　方　法 1．4．1　分组将精子悬液分为6组：正常组为PBS缓冲液(pH7.4)；模型组为HX―XO(HX终浓度为1mmol/L,XO终含量为50 mU/mL；阳性药对照组为维生素C(终含量为0.25mg/m