巴斯德毕赤酵母PEP4基因剔除及对基因工程菌.docVIP

巴斯德毕赤酵母PEP4基因剔除及对基因工程菌摘要：目的构建蛋白酶缺失菌株，提高外源蛋白质表达的分泌率与产量。 方法构建质粒pRS306/PEP4 LR，利用基因重组原理剔除巴斯德毕赤酵母中的PEP4基因。比较基因剔除前后外源蛋白质表达量的差异。 结果剔除毕赤酵母中的PEP4基因后外源蛋白质表达量平均提高9.5%。 结论剔除毕赤酵母中的PEP4基因可有效地控制外源蛋白质MIP表达时的降解。 关键词：巴斯德毕赤酵母；蛋白酶；PEP4基因 中图分类号：Q784文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)04-0010-04 Expression Optimization of Heterologous Protein in Pichia pastoris by Disrupting PEP4 Gene YANG Yang 1, ZHAO Jian1*, SHI Jun 2 (1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; 2. Model Organism Research Center, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Shanghai 200031, China) Abstract：Objective To create protease-deficient mutants for improving productivity and secretion efficiency of heterologous protein expression. Methods PEP4 gene of Pichia pastoris was disrupted by transforming with pRS306/PEP4 LR vector. Effects of the resultant PEP4 strain on heterologous protein expression were then measured by practical expression compared with the wild strain. Results By disrupting the PEP4 gene in Pichia pastoris, the productivity of heterologous protein expression increased 9.5% on average. Conclusion Disruption of PEP4 gene in Pichia pastoris is an effective method for controlling proteolytic degradation of heterologous protein MIP. Key words：Pichia pastoris; protease; PEP4 gene 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是较理想的外源基因表达系统[1]。在外源蛋白质的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量蛋白酶的表达。因此，不论是胞内表达还是分泌表达，大多数外源蛋白质均可能被降解，这是影响蛋白质表达量的重要因素，也增加了目的蛋白质纯化的难度。近年，蛋白酶成为P. pastoris表达系统研究的热点，越来越多的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究[2,3]。研究还表明，P. pastoris能根据细胞生长环境调整自身酶系，以合成或降解不同的蛋白质和细胞器。液泡是蛋白质降解的最主要场所[3]，另一降解场所是细胞基质蛋白酶体。 为防止基因工程表达的蛋白质被降解，目前较流行的是构建蛋白酶缺失菌株[4]，以提高产量及外源蛋白质表达的分泌率。一种完全缺乏蛋白酶的菌株需要剔除每个编码液泡蛋白酶的不同基因。幸运的是，有一种方法仅用一步即可消除大部分蛋白酶。液泡蛋白酶首先以无活性的酶原形式合成，然后在液泡中经蛋白质水解作用去除前肽变为活性肽。主要的蛋白质水解酶-蛋白酶A由基因PEP4编码，剔除PEP4就可阻止所有其他蛋白酶变为活性肽，这种方法的复杂性在于蛋白质水解酶B也能分解前肽从而激活液泡蛋白酶。在缺乏蛋白质水解酶A的情况下，有活性的蛋白质水解酶B仍能在几个细胞生长周期内继续激活液泡蛋白酶，但蛋白质水解酶B的自我激活能力并不是无限的，一旦其活性降低到某一临界值以下，细胞就会不可逆地转变为无蛋白酶细胞。剔除PEP4之后，再