氧化苦参碱对脊髓c-fos表达及对阿片受体作用探究.docVIP

氧化苦参碱对脊髓c-fos表达及对阿片受体作用探究摘要：目的：研究氧化苦参碱在大鼠福尔马林致痛模型中的镇痛作用以及对脊髓c-fos表达的影响，为了进一步阐明其镇痛作用机理，用放射性配受体法研究氧化苦参碱和阿片受体的亲和力。方法：大鼠腹腔给予马钱子碱，测定福尔马林足底注射后疼痛反应指标并用免疫组化方法测定马钱子碱对脊髓c-fbs表达的影响。以大鼠大脑为膜蛋白，用3H一二氢吗啡([3H]DHM)为放射性配基，测定氧化苦参碱和阿片受体的亲和力。结果：氧化苦参碱抑制福尔马林引起的I相和Ⅱ相反应(P99％)由中国药品生物制品检定所提供(批号110780-200405)，抗体稀释液购于北京中山生物有限公司，3H一二氢吗啡([3H]DHM，50～70Ci/mm01)购自PerldnElmer公司，牛血清白蛋白由浙江中医药大学生命科学系馈赠，Tris-HC]购自上海西唐生物科技有限公司，GF/F滤纸为英国Whatman公司产品，实验中所用试剂均为分析纯。实验中所用仪器包括Leica 2235型石蜡切片机、0-LYMPUS BX20型显微镜摄像机、BMJ-III型包埋机及冷冻台、GNP-9080型隔水式恒温培养箱、LKBl209液体闪烁计数仪、Sorvall牌离心机和uv-1700岛津分光光度仪。 2　方法 2.1　福尔马林实验　SD大鼠，体重200～250g，均由浙江中医药大学实验动物中心提供，随机分为3组，每组6只，空白组及生理盐水组腹腔注射(ip)生理盐水(10mL/kg)，氧化苦参碱组(Bm，30mg/kg，ip)。各组大鼠给药后30min，空白组不作处理，生理盐水组及氧化苦参碱组用5％的福尔马林50μL注入大鼠后足底皮下，将大鼠舔、咬右爪的时间作为疼痛反应的指标。记录注射福尔马林后0～10min(第1时相)和15～30min(第2时相)反应时间，空白组参照以上时间点记录反应时间。 2.2　灌注固定与取材　福尔马林溶液注射1h后，戊巴比妥钠麻醉，开胸经左心室插管，以右心房为出口，先灌注生理盐水200mL，后用4％多聚甲醛300mL灌注固定，60min后迅速打开椎板，取出腰骶膨大处，用多聚甲醛固定，2h后取材脱水，自来水洗30min，后分别用70％、95％、100％乙醇脱水，用二甲苯透明20min，共2次，浸蜡58℃～60℃ 3h，包埋组织，切片，厚4μm，连续切片，捞在预先APES处理的载玻片上，60℃～62℃烘箱(隔水式恒温培养箱GNP－9160)烤片6～8h，做免疫组织化学c-los染色。 2.3　石蜡切片的免疫组化染色　石蜡切片用二甲苯脱蜡，无水乙醇、95％、80％、70％乙醇至水化，蒸馏水洗，抗原修复采用高温高压修复(柠檬酸缓冲溶液，pH：6.0)，蒸馏水洗，PBS 5min×3次，3％H202阻断内源性过氧化物酶10min，PBS洗5min×3次，滴加适当比例稀释的一抗，4℃过夜，用PBS代替一抗为空白对照，PBS冲洗，滴加山羊抗兔IgG抗体－HRP多聚体，37℃孵育40min，PBS冲洗，5min×3次，DAB显色液显色1～3min，显微镜下控制反应，自来水冲洗终止反应，Harris苏木素液复染细胞核1min，95％、100％乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并计数Fos样免疫反应阳性神经元(Fos-LI)。阳性定位于细胞核为颗粒状和(或)块状的黄色或棕黄色，核仁不表达，阴性的细胞核为蓝色。每只大鼠随机取脊髓切片10张，镜下将右侧脊髓灰质分成10层，4个区，分别计数各区阳性细胞数及阳性细胞总和。 2.4　大脑膜制各和放射性配基结合实验　取SD大鼠两只，断头处死，迅速取出大脑组织(去除小脑)，按1：10加入0.32mol/L的冷蔗糖溶液，用组织匀浆器匀浆，6000～7000r/min，匀浆3次，每次20s，1000×g离心10min(4℃)，上清液及松散沉淀用40000×g离30min，沉淀物加入冰冷50mMTris-HCl(pH7.4)缓冲液至原体积，40000×g离30min，沉淀以Tfis液混悬后用Lowry法测蛋白，蛋白量为16.67μg/μL，放于-70℃备用。 2.5　竞争结合实验　取膜制剂15μL用50mMTris-HCl稀释成45μL，与50μL[3H]DHM及50μL纳络酮(10-6mol/L非特异结合管)或氧化苦参碱溶液(1×10-10-1×10-3mol/L竞争结合管)或Tris-HCl缓冲液(总结合管)，终体积为0.5mL，在室温下放置60min，在滤膜GF/F上加冷TrisHCI缓冲液3mL抽滤终止反应并进行分离，把带有已结合受体的滤膜移于液闪瓶中，加10mL闪烁液，用液闪仪计数。总结合管减竞争结合管计数除以总结合管减非特异结合管计数为药物对特异性结合