泽泻萜类化合物对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠肝脏基底膜HSPG调节作用.docVIP

泽泻萜类化合物对ApoE基因敲除动脉粥样硬化小鼠肝脏基底膜HSPG调节作用摘要：目的：观察泽泻萜类化合物对ApoE基因敲除小鼠实验性动脉粥样硬化肝脏基底膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖的调节作用。方法：将8周龄C57/BL小鼠12只设为正常对照组，8周龄ApoE基因缺陷小鼠36只随机分为3组：模型组、中药组、舒降之阳性对照组。正常对照组、模型组予0.9％生理盐水灌胃，给药组正常人每kg体重的10倍量灌胃90天后，全自动生化仪测定血清血脂含量，用免疫印记法测定各组肝脏基底膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖的表达，用Quantity One 6.0软件进行光密度分析。结果：中药组、阳性对照药组与模型组比较，总胆固醇、低密度脂蛋白水平均明显降低。中药组、阳性对照药组肝脏基底膜HSPG表达与模型组比较明显上调，但与正常对照组比较则明显下调。结论：泽泻萜类化合物对apoE-基因敲除高脂饲料喂养所致动脉粥样硬化小鼠具有降低血清总胆固醇、低密度脂蛋白的作用，对该模型小鼠的肝脏基底膜HSPG表达有调节作用。? 关键词：中药学；泽泻萜类化合物；血脂；硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）；动脉粥样硬化；ApoE基因敲除小鼠? 中图分类号：R285.5文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)04-0696-03 动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是心脑血管疾病的重要病理学基础，防止AS的发生及促使AS的消退是降低心脑血管病发病率和死亡率的根本措施。笔者在以健脾消痰化瘀为法的复方中药――以泽泻为主的降脂通脉方前期治疗高脂血症、动脉粥样硬化性疾病取得较好临床疗效基础上［1-2］，从整体动物水平进一步探讨泽泻萜类化合物调节C57/BL-apoE基因敲除小鼠血清脂质及泽泻萜类化合物对ApoE基因敲除小鼠实验性动脉粥样硬化肝脏基底膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖的调节作用。? 1材料与方法? 1.1实验动物8周龄的健康雄性清洁级C57/BL?ApoE基因敲除小鼠及8周龄的健康雄性清洁级C57/BL小鼠，由北京医科大学动物所提供。北京医科大学动物所清洁级实验室寄养。? 1.2实验药物泽泻萜类化合物，由北京中医药大学肖培根院士研究室提供。对照药：舒降之，杭州默沙东制药有限公司生产，生产批号：P1076。? 1.3动物造模及分组C57/BL?ApoE基因敲除小鼠以高脂饲料喂养（高脂饲料的配制：含0.15％胆固醇，21％脂肪的高脂饲料，由北京科澳颗粒有限责任公司提供），复制动脉硬化模型。分为4组：①正常对照组：C57/BL小鼠，饲以普通饲料，同时0.9％生理盐水灌胃。②模型组：C57/BL?ApoE基因敲除小鼠饲以高脂饲料，同时0.9％生理盐水灌胃。③中药组：饮食同造模组，泽泻萜类化合物灌胃。④西药对照组：饮食同造模组，舒降之灌胃。? 实验过程：将②、③、④组动物用高脂饲料喂养，同时中药组、西药对照组给予连续灌胃，给药方法：按正常人每kg体重的10倍量计算给药小鼠灌胃量，然后按每mL含10g小鼠灌胃量配制灌胃药液，按小鼠实际体重灌胃，每日给药1次，连续90天。? 1.4观测指标及方法①血清脂质含量的测定：实验90天，小鼠空腹禁食（不禁水）12h后，在3％水合氯醛麻醉下进行腹主动脉取血（采血量1mL），2000r/min离心15min，分离血清。血清中胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）应用总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白试剂盒（中德合资北京利德曼生化技术有限公司）在自动生化分析仪测定。? ②用免疫印记法测定肝基底膜 HSPG表达：实验90天，小鼠空腹禁食（不禁水）12h后，在3％水合氯醛麻醉下摘取肝脏。在冰冷匀浆缓冲液中匀浆，组织匀浆在16000g、4℃高速冷冻离心15min，留取上清，用lorry法测定组织液的总蛋白质的浓度。? 含蛋白质50μg的样品进行SDS?PAGE电泳→将蛋白用半干法转移至硝酸纤维素膜→5％milk/TBS溶液，轻摇30min，4℃封闭过夜→弃去封闭液用TBS洗膜3次→加入HSPG单克隆抗体于5％milk/TBS溶液中，加入0.05％tween-20 50μL，轻摇30min，孵育过夜→弃去一抗，用TBS洗膜3次→加入碱性磷酸酶标记的二抗于5％milk/TBS溶液中，轻摇30min，孵育过夜→弃去二抗，用TBS洗膜3次→用化学发光显影→用Alpha imager 2200型凝胶成像仪（美国Alpha Innotech公司生产）将膜转化为数字映象→用Quantity One6.0(Bio?Rad Laboratory)软件进行分析HSPG表达。? 1.5统计学处理各组间血脂结果均用（±s）表示，用方差分析。各组