HBVX基因对成人肝细胞HL7702线粒体功能的影响.docVIP

　　HBV X基因对成人肝细胞HL7702线粒体功能的影响 ：林纳, 李 丹, 陈红英, 陈治新, 王小众 【摘要】 目的: 研究HBV X基因与线粒体COXⅢ基因相互作用以及对线粒体功能的影响。 方法: 将HBV X基因真核表达载体pCDNA3X及空载体pCDNA3转染成人肝细胞HL7702细胞, 经过2周G418筛选, 获得稳定表达的新细胞株, 分别命名为HL7702/HBx和H7702/pcDNA3, RTPCR和: To study the effect of HBx on a neitochondria. METHODS: A rebinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3X ed HL7702/HBx and HL7702/pcDNA3. The expression of COXⅢ in HL7702/HBx, HL7702/pcDNA3 and HL7702 cells e c oxidase activities of three groups etrically at 550 nm by using partially purified mitochondria. RESULTS: COXⅢ mRNA expression didn’t change, e c oxidase activity uch loitochondrial cytochrome c oxidase activity. ［Keye c oxidase ［摘 要］ 目的: 研究HBV X基因与线粒体COXⅢ基因相互作用以及对线粒体功能的影响。 方法: 将HBV X基因真核表达载体pCDNA3X及空载体pCDNA3转染成人肝细胞HL7702细胞, 经过2周G418筛选, 获得稳定表达的新细胞株, 分别命名为HL7702/HBx和H7702/pcDNA3, RTPCR和r)约为16 500。X基因及其产物HBx在肝炎病毒慢性感染过程中直接或间接促进HCC的发生、 发展 。目前, HBx的亚细胞定位尚存在争议。Henkler等［1］发现X蛋白在低表达的细胞中完全或绝大部分定位于细胞核内, 而过量表达的X蛋白则分布于胞质中。另有学者观察到HBx在细胞质内的水平高于细胞核, 且细胞质中的HBx主要分布于线粒体外膜上［2］。 目前已证实HBx并不直接作用于双链DNA, 主要通过与细胞内多种蛋白质相互作用影响细胞的生物学功能, 故研究体内X结合蛋白对阐明X蛋白的作用及机制有重要作用。我们前期研究已经通过酵母双杂交体系从成人正常肝细胞cDNA文库中筛选出一种新的X结合蛋白细胞色素c氧化酶Ⅲ（cytochrome c oxidase Ⅲ, COXⅢ）［3］。细胞色素c氧化酶复合体是最具特征的呼吸链酶复合体, 由13个亚基组成, COXⅢ在复合酶的聚集和稳定性中起重要作用, 并参与质子的传递和细胞色素c氧化酶介导的能量转换［4］。 我们以成人肝细胞HL7702为研究对象的, 通过构建HBV X基因真核表达载体pcDNA3X, 并将其稳定转染给HL7702细胞, 检测HBx与COXⅢ的相互作用以及由此引起的线粒体结构和功能变化, 进一步阐明HBV的致癌机制。 1 材料和方法 1.1 材料 质粒抽提试剂盒购自深圳生物晶美公司、 pcDNA3表达载体购自Invitrogen公司; 重组HBV X基因真核表达载体pcDNA3X由本实验室保存。成人肝细胞株HL7702购自中科院上海细胞库, DMEM、 F12和胰蛋白酶购自Invitrogen公司。Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司; 逆转录试剂盒, JetPEITMGal转染试剂盒购自法国Polyplus transfection公司, TRIzol试剂购自Invitrogen公司; 线粒体抽提试剂盒购自Piecer公司; 线粒体细胞色素氧化酶活性检测试剂盒购自美国Sigma公司。小鼠抗人乙肝病毒X蛋白购自Chemicon公司, 山羊抗人COXⅢ多克隆抗体、 小鼠抗人βactin单克隆抗体（mAb）购自美国Santa Cruz公司, 兔抗小鼠二抗、 马抗山羊二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司, EM∶F12=3∶1）培养液中, 采用JetPEITMGal转染试剂盒将质粒pcDNA3和重组真核表达载体pcDNA3X转入HL7702肝细胞株中, 命名为HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx, 步骤如下: 选取对数生长期细胞, 消化接种于25 cm培养瓶, 细胞数为1×106/L, 待细胞贴壁后, 即可进行转染。取2支无菌试管, 分别加入5 μg DNA和16 μL Jet