低浓度H2O2对HL┐60细胞增殖的影响.docVIP

　　低浓度H2 O2 对HL┐60细胞增殖的影响 　　摘 要:目的 探讨低浓度H2 O2 对同步化处理或未经处理的HL-60细胞作用的时间效应关系. 方法 将培养的HL-60细胞进行同步化处理或取对数生长期细胞，施加不同浓度梯度的H2 O 2 影响，作细胞计数，四唑盐（MTT）比色试验检测细胞生存率，流式细胞技术测定细胞周期分布. 结果 低浓度H2 O2 作用组HL-60活细胞数明显高于未施加影响组，尤以H2 O2 终浓度为2μmol L-1 组作用明显（Plt;0.01），细胞周期也有轻度改变. 结论 低浓度H2 O2 作用HL-60细胞可使细胞数增加，其影响有时间效应关系，机制可能同其影响细胞周期有关. 　　Keyia，promyelocylic，a-cute;cell cycle 　　Abstract:AIM To investigate the effects of hydrogen per-oxide on human leukemic cells（HL-60）in vitro，and illus-trate its possible mechanism.METHODS Cultivated HL-60cells of synchronization or non-synchronization ber of living cells easured by MTT methods.Cell cycle distribution etry.RESULTS -pared ber of HL-60cells af-fected by lool L-1 arkable.The cell cycle changed slightly.CONCLU┐SION Lober of HL-60living cells.Its main mechanism might probably be involved in the change of the cell cycle. 　　0 引言 　　关于自由基、活性氧对机体损害的机制一直是研究热点.自从1981年美国学者Larry TT）购自华美生物有限公司. 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 　　HL-60细胞常规培养，培养液为含100mL L-1 小牛血清，青、链霉素各1×105 u L-1 的RPMI-1640，隔天换液. 　　1.2.2 细胞计数测细胞存活率 　　取对数生长期细胞，置4℃冰箱4h，使细胞低温同步化后取出，立即施加不同浓度梯度的H 2 O 2 溶液，浓度范围0.1μmol L-1 至10mmol L-1 ，设阴性对照，37℃温育.取处理后不同时间点终止培养，4g L-1 台盼蓝溶液染色，计数活细胞和细胞总数. 　　1.2.3 四唑盐（MTT）比色法检测细胞活力 　　取对数生长期细胞，调整细胞密度为5×10 5 mL-1 ，以每孔0.2mL接种96孔板，共五板，37℃，50mL L -1 CO 2 孵育.次日晨每板分12个组，每组8个平行孔，按不同终浓度分别加入H 2 O 2 溶液，浓度梯度如下:0.01，0.1，1，2，5，10，20，50，100，1000μmol L-1 ，无H2 O2 组，单纯培养基组.五块板分别于0，1，2，3，4d取出，加5g L-1 MTT溶液20μL/孔，37℃温育4h后吸取上清，加二甲基亚砜（EMSO分析纯）150μL，震荡10min，使紫色结晶物充分溶解，用酶联免疫计数仪，波长为490nm，测定各孔吸光度. 　　1.2.4 细胞周期DNA分布测定 　　取对数生长期细胞，无血清培养液培养24h使细胞同步化，离心去除无血清培养基，加入含100mL L-1 小牛血清的1640培养基，稀释细胞密度为5×105 mL-1 ，分别加入12孔板，每孔容积为2mL.取6孔各施加终浓度为2μmol L-1 的H2 O2 溶液，另6孔各加入等体积三蒸水.37℃，50mL L-1 CO2 孵育，于不同时间点（0，2，6，12，18，24h）同时取施加影响组和阴性对照组各一孔细胞，置两只离心管中以800r min-1 离心5min，PBS洗两次，弃上清，700mL L-1 乙醇固定，4℃存放待测.测定时离心去上清，PBS洗涤2次，加入碘化丙啶，避光染色15min，FACSPLUS流式细胞仪进行细胞周期测定. 统计方法:结果以本校卫生统计学教研室统计软件SPLM作重复测量方差分析［5］ . 　　2 结果 　　2.1 细胞计数 　　低浓度剂量H2 O2 （1μmol L-1 ）作用HL-60细胞后，光镜下观察见细胞外形规则，边缘光滑，折光性好，死亡细胞很少，增殖活跃，活