非融合型重组人骨唾液蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化.pdfVIP

药 物 生 物 技 术 Pharmaceutical Biotechno1ogy 2008，15(1)：11～14 非融合型重组人骨唾液蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化 王江涛，王 捷 ，廖新梅，张宏斌 (广州军区广州总医院医学实验科，广东广州510010) 摘 要 通过正交设计对毕赤酵母GS115／pPICZaAN-hbsp工程菌的发酵条件(菌体密度、甲醇诱导浓度、 初始pH值、诱导时间)进行优化。采用重组人骨唾液蛋白(recombinant human bone sialoprotein，rhBSP)单克 隆抗体与Aldehyde_Resin HP FF介质偶联制备免疫亲和层析柱，纯化非融合型rhBSP，并用Western blotting和 补体抑制实验检测非融合型rhBSP的抗原性和活性。毕赤酵母GS115／pPICZaAN-hbsp工程菌最佳发酵优化 为：菌体密度OD6。。达到45甲醇诱导剂量为1．5 ，pH值6．0，诱导时间2 d，最大表达量为0．126 mg／ml。经免 疫亲和层析法纯化后，SDS显示非融合型rhBSP为43～66 ku的分散条带，纯度在9O 以上，Western- blotting显示rhBSP具有良好的抗原性，补体实验证明纯化的非融合型rhBSP活性很好。毕赤酵母GS115／ pPICZaAN-hbsp工程菌发酵条件经优化后能高效表达非融合型rhBSP，应用免疫亲和层析方法纯化的非融合型 rhBSP纯度好，活性高，为进一步研究非融合型rhBSP打下了基础。 关键词 毕赤酵母；优化；非融合型重组人骨唾液蛋白；免疫亲和层析；纯化；活性 中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：1005—8915(2008)01—0011一O4 骨唾液蛋白(Bone sialoprotein，BSP)自从 AN—hbsp工程菌的发酵条件进行了初步优化，然 1972年首先从牛骨皮质中分离出来，至今已从人、 后将 rhBSP单克隆抗体与填料 Aldehyde—Resin 牛、兔和猪的骨中分离出该蛋白。BSP在N端有 HP FF偶联获得BSP亲和层析介质，对非融合型 2～3个谷氨酸组成的多聚谷氨酸序列I1]，参与羟 rhBSP进行纯化，并用补体实验证明了纯化的非融 磷灰石晶体核形成和组织矿化，并介导成骨细胞、 合型rhBSP的活性。 破骨细胞和内皮细胞与骨矿物质的结合，与多种骨 1 实验材料与试剂 代谢性疾病¨2]肿瘤的骨转移、动脉粥样硬化、血管 增生有关 。， 。 工程菌株毕赤酵母GS1 1 5／pPICZaAN—hbsp， 目前rhBSP已在大肠杆菌和哺乳动物细胞中 广州军区广州总医院医学实验科构建¨1叩；rhBSP 表达_5 ]。而酵母表达系统表达外源基因既具有 的单克隆抗体(IgG 型)，广州军区广州总医院医 原核生物发酵快速、简便的特点，又具有真核生物 学实验科制备¨1 ；进口鼠抗人BSP单克隆抗体 对表达蛋白进行翻译后修饰的能力。应用毕赤酵 (IgG1型)，Chemicon公司；酵母基本氮源 (Yeast 母GS115融合表达的rhBSP带有组氨酸标签[7 ]， Nitrogen Base，YNB)，Genview公司；胰蛋白胨和 采用固定化金属离子亲和层析法可以方便地纯化 酵母浸出粉，英国Oxoid公司；生物素，Sigma公 蛋白，但是短肽尾巴的加入可能会改变蛋白的折叠 司；Aldehyde-Resin HP FF介质，北京卓冠科技有 形式，从而影响其生物活性和功能I9]。而毕赤酵母 限公司。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP GSl15／pPICZaAN-hbsp工程菌的构建u 0l和BSP (二抗)，美国Santcruz公司；硝酸纤维膜(NC膜)， 单克隆抗体的制备¨11]为