第6章蛋白质理化性质及分离纯化.pptVIP

茶学与生物系 张 剑 核糖核酸酶变性与复性作用 ★纯化的实质：增加制品的纯度或比活性。 ★一般程序： （1）前处理（即提取）、 （2）粗分级分离 （3）细分级分离 （4）浓缩与保存。 ★ 分离纯化蛋白质的主要方法： 1.定义：利用蛋白质分子对其配体分子（或配基）特有的识别能力，也即生物学亲合力，建立起来的一种有效的纯化方法。 2.配基：酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，凝集素。配基先结合到琼脂糖等介质上作为固定相。 3.原理：先用不含配基的洗脱剂进行洗脱，将被分离蛋白质以外的杂志洗出来；然后用含配基的洗脱剂进行洗脱，将被分离的蛋白质洗出来。 4.常用方法： 免疫亲和层析、金属螯和层析、染料配体层析 1.定义：蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 2.几种重要的蛋白质电泳： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于Pr分子量的测定。 等电聚焦电泳，通过Pr等电点的差异而分离Pr 双向凝胶电泳，是蛋白质组学研究的重要技术。 单 体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺 增速剂：TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺) 引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素 等电聚焦（isoelectric focusing，IEF） 1.定义及原理：电泳的支持物预先制成pH梯度(蔗糖作介质），蛋白质混合物进行电泳时，各种蛋白质将聚焦于其等电点的pH梯度处，从而形成一明显区带。PI只有0.02个差异甚至小于0.02的差异就可以分离。可将人血清分成40多个区带。 2. pH梯度制作：采样两性电解质ampholyte,商品名为ampholine，是脂肪族多胺和多羧类的同系物，它们具有相近但不相同的pKa和pI。在外电场作用下，自然形成pH梯度。 双向电泳 1.定义及原理：第一向是等电聚焦，第二向是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2.特点：分辨率高，能分辩出3000种不同的蛋白质。成为蛋白质组学研究有力的技术手段。 第五节?????蛋白质的理化性质与分离纯化 特别适用于同工酶的鉴定 及用于蛋白质等电点的测定 等电聚焦电泳法测定蛋白质pI 第五节?????蛋白质的理化性质与分离纯化 Native ribonuclease Denative reduced ribonuclease Native ribonuclease 8 M urea and ?-mercapotoethanol Dialysis 变性 复性 5.变性与复性 （一）蛋白质的重要性质 分类：可逆变性与不可逆变性 沉淀与变性的关系： ①变性蛋白质并不一定都表现沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性（如可逆沉淀）。 ②不能复性的变性即不可逆变性一定产生沉淀，不可逆的沉淀一定变性。 制备活性蛋白质时要严防蛋白质变性。 第五节?????蛋白质的理化性质与分离纯化 6.蛋白质的颜色反应 （一）蛋白质的重要性质 1）双缩脲反应 第五节?????蛋白质的理化性质与分离纯化 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。 双缩脲在稀碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。 通常可用此反应来定性鉴定蛋白质； 根据反应产物的在540nm处颜色深浅，进行蛋白质水解程度的测定及蛋白质的定量。 2）黄色反应（定性鉴定） 第五节?????蛋白质的理化性质与分离纯化 蛋白质加浓硝酸——白色沉淀——变黄色——加碱变橙黄色。因为蛋白中芳香族氨基酸（Try、Phe、Trp），苯基与浓硝酸起硝化作用，产生黄色的硝基取代物，遇碱又形成黄色的盐（硝基苯衍生物）。 皮肤遇硝酸变黄 蛋白质的颜色反应 蛋白质的颜色反应 3）米伦反应 第五节?????蛋白质的理化性质与分离纯化 含有酪氨酸的蛋白质，加入米伦试剂（HgNO3，HgNO2，HNO3，HNO2的混合液）反应，先产生白色沉淀，加热后变成专红色。 4）乙醛酸反应 含有色氨酸的蛋白质，与乙醛酸混合后，沿壁慢慢加入浓硫酸，两液层之间出现紫色环。 蛋白质的颜色反应 5）酚试剂（Folin-酚试剂）反应 第五节?????蛋白质的理化性质与分离纯化 含酪氨酸蛋白能将Folin-酚试剂中的磷钼酸及磷钨