Ni-IDA亲和层析介质-南京金斯瑞生物科技有限公司.PDF

Ni‐IDA 亲和层析介质    1. 产品描述  金斯瑞 Ni‐IDA 亲和层析介质（产品编号 L00223‐I）是把 IDA （亚氨基二乙酸）共价偶 联到 4 %交联的琼脂糖介质上，再通过 IDA 的 3 个结合位点螯合 Ni2+制备而成，并提供了三 个离子键结合部位高亲和地纯化含有多聚组氨酸标签的重组蛋白。金斯瑞 Ni‐IDA 亲和层析 介质的 Ni2+脱落程度很低，并具有高吸附量及高稳定性，在多聚组氨酸标签的重组蛋白的 纯化实验中有非常好的表现力，具体特性见表 1。  表 1. Ni‐IDA 亲和层析介质的特性  柱体积  10 ml 动态吸附量  20 mg 6×His 标签蛋白（27 kD）/ml 介质  球形基质  4 %交联度琼脂糖  平均粒径  90 μm  （45‐165 μm）  储存溶剂  1× PBS （含20%乙醇）  储存稳定性  2‐8 ℃储存 18 个月    2. 纯化步骤  天然条件下纯化多聚组氨酸标签蛋白  2.1 缓冲液配制  用于配制缓冲液的水和化学试剂必须是高纯度的，并建议使用前用 0.45 μm 滤膜过滤一遍。  平衡缓冲液：50 mM NaH PO ，300 mM NaCl，用 NaOH 调 pH 为 8.0  2 4 洗涤缓冲液：50 mM NaH PO ，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，用 NaOH 调 pH 为 8.0  2 4 洗脱缓冲液：50 mM NaH PO ，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，用 NaOH 调 pH 为 8.0  2 4 2.2  样品制备  A.  大肠杆菌系统或酵母胞质系统表达蛋白  （1）在4 ℃条件下用 50 ml 离心管离心收集细胞；  （2 ）用8 ml 平衡缓冲液重悬细胞，可以加入适量的 PMSF 或其他蛋白酶抑制剂；  注意：加入的抑制剂不能对 Ni‐IDA 亲和层析介质的性能有影响，破碎液中不能含有 EDTA、EGTA 等螯合剂，DTT、巯基乙醇等还原剂，尿素、盐酸胍等变性剂。  （3 ）超声破碎细胞，在冰上进行操作，破碎 1 秒，冷却 3 秒，总时间为 30‐45 分钟；  可选：如果裂解物太粘稠，可以加入 RNase A  （终浓度10 μg/ml ） 和 DNase I  （终浓 度 5 μg/ml ） 并在冰上孵育 10‐15 分钟。  （4 ） 4 ℃，1,2000 rpm 离心裂解液以沉淀细胞碎片，收集上清液待过 Ni‐IDA 亲和层析介质。  B.   酵母、昆虫或者哺乳动物细胞表达系统分泌到培养基中的蛋白  （1）如果培养基上清中不含有 EDTA、组氨酸或者其它还原性试剂等可能影响 Ni‐IDA 亲和 层析介质性能的话，该培养基可以直接上柱纯化，否则必须进行下面步骤；  （2 ）上柱前将样品透析于 1×PBS 中；  （3 ） 对于较大体积的培养基上清，可以通过硫酸铵沉淀浓缩蛋白，用 1×PBS 透析溶解的 蛋白，准备上样。  2.3 柱子制备  （1）轻轻颠倒翻转瓶子几次，使介质混合均匀；  （2 ）吸取一定量的介质加入到柱子中，让介质自由沉降，并放干储存液；  （ 3 ）加入4 倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析介质或者直到流出液的紫外吸光度 A280 值达 到最低且稳定。  2.4  柱子纯化  （1）将含多聚组氨酸标签蛋白的澄清样品上样至柱中，流速控制为0.5‐1 ml/分钟，收集流 出液以待后续分析；  （2 ）以流速为 1 ml/分钟的洗涤缓冲液洗涤柱子以去除杂蛋白，一般用量为 8 倍柱体积， 或者直到流出液的 A280 值达到最低且稳定；  （3 ） 用 5‐10 倍柱体积的洗脱缓冲液以 0.5‐1 ml/分钟的流速洗脱，收集洗脱液。或者根据 流出液 A280 值判断，当数值陡然上升时开始接收洗脱液，直到 A280 数