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第五章 蛋白质III ：蛋白质的性质、分离与鉴定 第一节 蛋白质的性质 一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质等电点（pI ） 二、蛋白质分子的大小与形状 道尔顿（dalton ）, kilodalton 寡聚蛋白质（oligometric protein ） 超分子复合物（supramolecular complex ） 蛋白质分子量可粗略估计（AA平均分子量 约为110 dalton） 三、蛋白质的胶体性质 质点范围：1-100 nm 蛋白质胶体系统稳定的原因： 水化层（hydration mantle ）（亲水基团） 双电层（electric double layer ）（相同电荷） 四、沉淀蛋白质的方法 （一）盐析法 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐，能脱 去蛋白质分子水化层，并中和其电荷，从 而使蛋白质从溶液中沉淀出来。中性盐的 这种沉淀作用叫盐析作用（salting out ）。 用途：浓缩、分级分离。 （二）有机溶剂沉淀法 （三）重金属盐沉淀 （四）有机酸沉淀法 （五）加热变性沉淀法 第二节 蛋白质的分离纯化 一、蛋白质分离提纯的一般原则 高纯度、高活性、高回收率 二、蛋白质的分离方法 （一）根据分子大小不同的分离方法 1.透析（dialysis ）和超滤（ultrafiltration ） 半透膜 （玻璃纸，火棉纸） 透析常用于蛋白质溶液的除盐 超滤常用于蛋白质溶液的除盐、浓缩 2. 密度梯度离心 （density gradient ultracentrifugation ） 常见有蔗糖密度梯度（连续、不连续） 质量和密度大的蛋白质分子沉降快 3.凝胶过滤（filtration chromatography ） 分子筛层析，分子排阻层析 Sephadex G-50 分离范围：1 500-30 000 交联葡聚糖 （Sephadex ） 聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P ） 琼脂糖凝胶 （Sepharose，Bio-Gel A ） 凝胶过滤原理 当蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比 凝胶网孔大的分子不能进入网状结构内， 而被排阻在凝胶颗粒外，随着溶剂在凝 胶颗粒之间的孔隙向下流动，而最先流 出柱外；比网孔小的分子能不同程度的 自由出入凝胶颗粒的内外，形成一个动 态平衡。这样，由于不同大小的分子所 经的路径不同而得到分离。 （二）利用溶解度差别的分离方法 1. 等电点沉淀 2. 蛋白质的盐溶与盐析 3. 有机溶剂分离法 4. 温度对蛋白质溶解度的影响 （三）根据电荷不同的分离方法 1 电泳（electrophoresis ） 在一定的电场和介质中，蛋白质迁移速度 与蛋白质分子量、所带电荷及分子形状有 关。 a. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis （PAGE ） 丙烯酰胺和交联试剂（甲叉双丙烯酰胺）在过 硫酸铵催化下聚合而成。 可以控制孔径大小 迁移率＝某一蛋白条带移动距离/前沿到达距离 b. 不连续电泳（discontinuous electrophoresis 凝胶孔径（浓缩胶，分离胶）、缓冲液、pH 三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩效应 c. 毛细管电泳（capillary electrophoresis ） 50 µm 内径 d. 等电聚焦电泳 isoelectric focusing electrophoresis （IFE ） 蛋白质在具有pH梯度的介质中进行分离。 在电场中，每种蛋白质成分将移向并停留 在等于其等电点的pH处，形成一个很窄 的区带。 用途：按等电点分离蛋白质 鉴定蛋白质等电点 双向电泳 2. 离子交换柱层析 （ion-exchange chromatography ） 纤维素离子交换剂 阳离子交换剂: CM-Cellulose(羧甲基纤维素) 阴离子交换剂:DEAE-Cellulose(二乙基氨基纤维 葡聚糖离子交换剂（Sephadex ion exchanger ） 兼分子筛效应 （四）根据蛋白质的吸附特性分离 填料有： 羟基磷灰石、活性碳、硅