第四章-酶的提取与分离纯化.ppt

酶纯化的基本原则： ①建立一个方便灵敏的分析方法； ②选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤； ③常在低温（4℃）条件下进行纯化，以避免酶的变性。 提取原则 a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。 （二） 有机溶剂沉淀（降低介电常数） 利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。 1. 沉淀机理 降低溶液的介电常数 部分地引起蛋白质脱水 2. 常用有机溶剂 乙醇、丙酮、甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。 3.优缺点： 优点：1）分辨率比盐析法高 2） 沉淀不需脱盐 3）溶剂易蒸发，沉淀易离心 缺点：1）容易引起蛋白质变性失活 2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。 （三） 等电点沉淀(isoelectric precipitation) 1.原理 蛋白质在等电点时溶解度最低 不同的蛋白质具有不同的等电点 2. 使用方法 单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。 根据推动力的产生条件不同，过滤分为三种： 常压过滤 加压过滤 减压过滤 2.非膜微滤：微孔陶瓷，烧结金属作介质 3.用途 蛋白纯化中，除去无机盐等小分子物质。 缺点：透析时间较长，透析后体积较大，浓度 较低，难于工业化生产。 通常用纤维素、聚砜等材料制成，使用时要注意膜的正反面。 使用后要及时清洗，一般可用超声波、中性洗涤剂、蛋白酶液、次氯酸盐及磷酸盐等处理，使膜基本恢复原有通水量。 如果暂不使用，可浸泡在加有少量甲醛的清水中保存。 第六节 层析法 层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。 一、层析法的基本原理 利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移动而达到分离的目的。 mobile phase：携带样品流过整个系统的流体 stationary phase：静止不动的一相 二、层析法的分类 按层析过程的机理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数的不同。 离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。 亲和层析：利用生物分子与配基之间专一而又可逆的亲和力。 层析聚焦：将酶的等电点特性和离子交换特性结合在一起。 3.吸附剂 吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等与待分离物质的极性官能团作用。 根据吸附能力强弱分为： 弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙[Ca10(PO4)6.(OH)2] 、硅胶(极性)等 强吸附剂：氧化铝、活性炭(常用) 1. 基本原理 大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来； 小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱。按分子量由大→小顺序流出层析柱。 3）加样 体积不能过多，不超过床体积的5％，脱盐时可在10％左右。 4）洗脱 洗脱液与平衡时用的buffer一致。 洗速不可过快，保持恒速。 5）胶的保存 洗脱完毕后，凝胶柱已恢复到上柱前的状态，不必再生处理。 用0.02%NaN3防腐。 （三）离子交换层析 （ion exchange chromatography，IEC） 1.原理:利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同而达到分离的 纯化方法。 3）再生：用0.5mol/LNaOH或0.5mol/L HCl处理。 4. 应用 分离纯化生物大分子 （五）亲和层析(Affinity Chromatography) 由吸附层析发展起来的 ，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。 又称： 生物专一吸附（biospecific adsorption）选择层析（selective chromatography） 层析聚焦的操作过程： 1.选择适宜的多缓冲液