非连续多核苷酸定点突变的方法.pdfVIP

( ) 生物工程学报12 增刊 :146～151 ,1996 Chinese J ournal of B iotechnology 　　　　　 非连续多核苷酸定点突变的方法 王易伦 　张平武 　戴建新 　郭瀛军 　陆德如 (第二军医大学分子遗传教研室　上海 　200433) ( ) α ( α ) 摘 　要 　以人粒巨噬细胞集落刺激因子 h GMCSF 、人 8干扰素 h IFN 8 和分裂细胞核抗原 ( PCNA) 的cDNA 定点突变为例 ,建立了一种新的大区域非连续多核苷酸同步定点突变的方法 。 经碱变性后的质粒 DNA ,先用突变引物延伸单链 ,然后通过 PCR 扩增得到突变双链 DNA 。用该 α 方法成功地改造了h GMCSF 基因 5′端 36 个核苷酸中的 9 个位点、IFN 8 基因 5′端 39 个核苷酸 中的9 个位点和 PCNA 基因 SD 顺序两侧 6 个和 7 个核苷酸 。与经典的含 U 单链寡核苷酸定点 突变方法相比,本方法突变效率高 ,并省去了对突变克隆杂交筛选的操作 。 关键词 　基因 ,定点突变 ,PCR 在核苷酸顺序水平进行定点突变 ,进而改造蛋白质的结构 ,是目前研究生物大分子结构 与功能关系常用的策略和方法[ 1] 。本文建立了一种突变引物延伸单链与 PCR 技术相结合 的方法 ,它能有效地对目的基因进行大区域非连续多核苷酸的定点突变改造 。 1 　材料和方法 11 　工具酶和试剂 ( ) ( ) ( ) Klenow Boehringer 公司 ,PCR 试剂盒 PE 公司 ,DNA 测序试剂盒 U SB 公司 ,化学试 剂均为市售分析纯 。 12 　D NA 模板 ( ) ( ) α 含人粒巨噬细胞集落刺激 因子 h GMCSF cDNA 的质粒 p ZP6 、含人 8 干扰素 ( α ) ( ) ( ) ( ) h IFN 8 cDNA 质粒 p ZP3 和含人分裂细胞核抗原 PCNA cDNA 的质粒 p GEM2 均为本 室保存 ,质粒 DNA 按常规碱裂解法制备 。 13 　寡核苷酸引物合成 采用固相亚磷酸三酯法合成 。由本室或中国科学院细胞生物学研究所完成 。 14 　非连续性多核苷酸定点突变 μ ( ) μ ( ) μ 141 碱变性 :取约 1 g 纯化的质粒 DNA 含待突变基因 ,溶于 12 l TE p H8. 0 中,加 4 l μ ( ) μ 1mol/ L NaOH , 37 ℃,5min ,加 4 l 10mol/ L N H4Ac p H7 . 6 , 加 50 l 乙醇 , - 20 ℃,沉淀过 夜 。 μ μ 142 突变单引物延伸 :离心沉淀碱变性DNA ,抽干后 ,溶于7 lH O 中,加 1 l 延伸反应缓冲 2 (