材料与方法华南农业大学.DOC

2 材料与方法 2.1 供试材料与主要仪器 2.1.1供试昆虫 本论文所采用试虫列于表2.1。 斜纹夜蛾的饲养：。挑选整齐一致的F1或F2代适龄幼虫供试。 菜粉蝶的饲养： 从田间未施药的芥兰（Brassica alboglabra Bailey）或甘蓝（Brassica oleracea L. var capitata L.）采回幼虫饲养至成虫，。成虫在芥兰产卵，幼虫以芥兰或甘蓝饲喂。或直接从田间采回健康幼虫供试。 小菜蛾的饲养： 。 致倦库蚊的饲养：取适龄幼虫供试(王延年等，1984；王新国，2001)。 以上田间采集地点，未明确指明的，均为华南农业大学教学实验场。 2.1.2供试化合物和主要试剂 供试系列化合物均从黄杜鹃花中提取获得。具体方法见“2.2 化合物的提取分离与鉴定”。 主要化学试剂 本论文所用主要试剂，等均为市售AR。 主要药品，如等为国产AR。 腺苷三磷酸（ATP）等原装进口或进口分装。 表2.1 供试昆虫种类 中文名 学名 英文名 所属科目 来源 菜粉蝶 (略) 2.1.3主要仪器设备 2.1.3.1提取分离主要仪器设备 植物粉碎机(FE-130和DFE-90)：河北黄骅科学仪器厂 2.1.3.2活性测定主要仪器设备 LI-3000型叶面积自动测定仪（LI-3000 Portable area meter）： 2.1.3.3鉴定和检测主要仪器设备 2.1.3.4 作用机理研究主要仪器设备 TGL-16B高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂 2.2杀虫成分的提取分离和鉴定2.2.1植物来源 黄杜鹃（Rhododendron molle G. Don），杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（Rhododendron），1998~2001年每年3、4月采自广东省曲江县和乳源县。 2.2.2总成分提取方法 采用浸泡提取法。 少量提取时放入冰箱中备用。 MeOH浸提物的分离，参考Klocke等（1991）、胡美英等(1992)，。对最高活性萃取物进行硅胶柱层析。 2.2.3 硅胶柱层析分离 对EtOAc萃取物进行硅胶柱层析，以进一步分离或结晶提纯。 2.2.4 反相柱层析分离 EtOAc萃取物经硅胶柱(包括100~200，200~300目或硅胶H等)层析，。。否则，将反复进行反相柱层析，或者进行凝胶柱层析等方法的分离提纯。 2.2.5 凝胶柱层析分离 对反相柱难以分开，成分又比较简单(一般只有2~3个)的流分，，仅为一圆斑点者可供生测和结构鉴定。 2.2.6 硅胶薄层制备分离 对已知几种成分的简单混和物采用硅胶薄层层析（TLC）制备分离。。 2.2.7 高效液相色谱制备分离 将成分简单(一般是2~3个)的流分，。逐管点板，分别以不同极性比例展开剂展开，浓缩检验。 2.2.8 化合物结构鉴定 以上述分离方法所得的化合物，通过以下方法进行结构鉴定。 核磁共振谱(NMR) 。 质谱(MS) 。 紫外光谱(UV)。 红外光谱(IR) 。 比旋光度 以甲醇溶解供试样品(浓度0.05~0.2g/100mL)，甲醇作参比，按下式计算旋光度， 2.3 闹羊花素-III的定量检测方法 R-III在紫外光波长范围内无最大吸收，。每次测定均在同一硅胶板上制作曲线，随行测定样品浓度(罗健等，1999)。 2.3.1 试剂和溶液 闹羊花素-III标准品：已知含量(99.0% 2.3.2 主要仪器和检测参数 主要仪器见2.1.3。主要检测参数如下： 扫描方式： (略) 层析板： 2.3.3 测定步骤 2.3.3.1层析板制备 称取适量硅胶G，，置干燥皿中备用。 2.3.3.2 标准溶液制备 称取R-III标样备用。 2.3.3.3薄层层析 取一块活化好的层析板，。当展开剂上升到一定高度时，将层析板取出，放在通风橱内，使溶剂挥发至干。 2.3.3.4薄层扫描 对展开剂挥发净的层析板，。 2.3.4 标准曲线的绘制 将各浓度标准液准确点样按最小二乘法制作标准曲线。 2.3.5 闹羊花素-III含量的测定 2.3.6 准确度试验 准确量取。2.3.7 精密度试验 2.3.8 稳定性试验 2.4 生物活性测定方法 2.4.1 产卵忌避活性测定 2.4.1.1 对菜粉蝶的产卵忌避活性测定 非选择性试验 ，按式3计算非选择性忌避率。2.4.1.2 对小菜蛾的产卵忌避活性测定 非选择性试验 参考崔德君等（1998）、钟国华等(2000a)方法。。检查、计算方法同2.4.1.1非选择性试验。 选择性试验 将各处理和CK菜苗一并随机放入90cm×45cm×30cm的养虫笼内。按1对/株接入羽化1~2d的成虫(性比为1）。每处理3重复。余同非选择性试验。 2.4.1.3 对初孵