细胞培养标准流程.docVIP

细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL） 漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 细胞转染 TurboFect 转说明书附后） 细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。 以6 孔板为例，转染前细胞先换液，加ml全培1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL，混匀（转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。 (转染试剂需加在培养液中部，切忌勿贴壁;静置时间不可超过20 min） 无血清无双抗DMEM量＝全培体积的10％。如6孔板mL培养液培养，即转染体系为00ul无血清无双抗DMEM。 24～48 h 后收集细胞用于后续实验。 Note：如果用这种方法转染效率一直不佳，可以在接种细胞前，把转染试剂配好，把转染试剂加到培养盘上，再把细胞接种上。该方法不适用所有细胞，这种方法会导致细胞死亡，不贴壁。 HiPerFect?转染试剂转染（用于siRNA的转染，说明书附后） For transfection of eukaryotic cells with siRNA and miRNA 以6 孔板为例，转染之前，以2mL全培接种1.5-6105?细胞于孔板每孔。 将细胞放置在培养箱中培养，直至转染 取1.5 ml 离心管，加入100 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入siRNA(20uM浓度，相当于0.25ug/μL)5uL,转染试剂12μL，轻轻混匀，室温静置5-10 min。 siRNA：转染试剂：无血清无双抗DMEM 5uL：12ul：100ul将步骤3混合液缓慢均匀加到培养液后，轻轻晃动圆盘，使其均匀分布。 24～48 h 后收集细胞用于后续实验。μLDMSO+900μL细胞悬液。 5) 冻存顺序：用冻存仪（程序性降温盒）－80℃过夜→液氮。 或者4℃半小时→－20℃2小时→ －80℃存储。 冻存仪的使用方法 1、确认冻存仪内的异丙醇是否已经使用5次，准备细胞，放入冻存盒（最多18管）。 2、将冻存盒放入-80℃冰箱，并登记信息（冻存者，冻存细胞名称，异丙醇使用次数） 3、至少三个小时后（过夜），将细胞取出放置于自己的细胞盒内或液氮中。 4、将冻存盒取出放回原处。 冻存盒内需放置250ml的异丙醇，异丙醇使用4-5次后需要更新 4、细胞复苏 （DMEM培养液+10%FBS+1%双抗） 准备37℃水浴箱，10mL离心管，配制相应培养基，标记好培养皿。 （离心管和培养皿可提前加好约5ml培养基） 2) 将取出的细胞冻存管快速投入到温水中，同时手握冻存管快速搅动，让细胞以最快的速度融解。 3）吸取所有融化的细胞悬液至加有5倍体积培养基的离心管中。 4）离心800rpm，3min。 5）弃上清，加全培重悬细胞。 6）依次加2ml细胞悬液和10ml全培入新培养皿。 （6cm小圆盘上加入 2 ml的全培;10cm大圆盘上加入10ml的全培）。 7）混匀(十字混匀)，CO2培养。 标准程序： 3）离心1000rpm，2-3 分钟；弃上清，加入1ml全培重悬后转入10ml管，再加入4-5ml全培重悬 4）离心1000rpm，2-3 分钟，离心期间，在6