绞股蓝皂苷对糖尿病肾病大鼠肾组织转化生长因子β1表达影响.docVIP

绞股蓝皂苷对糖尿病肾病大鼠肾组织转化生长因子β1表达影响摘要：目的：探讨绞股蓝皂苷对糖尿病肾病大鼠肾脏中转化生长因子β1(TGF－β1)表达的影响，以了解其对早期糖尿病肾病的防治作用和分子机制。方法：采用单侧肾切除加STZ注射法改良复制糖尿病肾病模型，实验分为正常组、模型组、治疗组(绞股蓝皂苷高、中、低浓度及人参皂苷Rb1对照组)，观察糖尿病肾病模型大鼠一般情况、生化指标、肾组织病理变化、肾脏中TGF－β1mRNA及蛋白表达水平。结果：治疗组一般情况、生化指标、肾组织病理变化均优于模型组，同时TGF－β1mRNA及蛋白表达水平也较模型组明显下调，其中中剂量组与人参皂苷Rb1对照组的作用相接近。结论：绞股蓝皂苷可用于治疗早期糖尿病肾病，其机制可能与下调TGF－β1高表达，减少肾小球系膜区EGM的积聚有关。 关键词：绞股蓝皂苷；糖尿病肾痛；转化生长因子β1；细胞外基质 中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2007)09－1922－04 糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的并发症之一，是其致死致残的主要原因，故早期治疗，延缓其进展，改善其预后至关重要。迄今为止，DN的发病机制尚未完全阐明，对其分子细胞机制的探讨是近年来研究的热点之一，转化生长因子β1(TGF－β1)是DN复杂的细胞因子网络中的核心因子。本研究通过观察绞股蓝皂苷对DN大鼠肾组织内TGF－β1表达的影响，以探讨其改善DN的作用机制。 1 材　料 1．1　动　物 健康SD大鼠60只(体重180－220g，雌雄各半，由浙江中医药大学实验动物中心提供)，实验期间自由饮水和摄食，适应性喂养1周，取血糖、尿蛋白阴性、健康状况良好者为实验对象。 1．2　药品与试剂 绞股蓝总甙片：陕西安康制药厂产品(批号：国药准字；人参皂苷Rb1：中国药品生物制品检定所提供；链脲佐菌素(streptomn，STZ)均由美国Sigma公司提供；PAS染色试剂盒由上海虹桥医用试剂研究所提供；兔抗大鼠TGF－β1单克隆抗体由美国Santa Cruz公司提供；生物索标记的羊抗兔IgG由武汉博士德生物工程有限公司提供；即用型第二代免疫组化ElivisionTMplus广谱试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；二氨基联苯胺(DAB)显色剂为华美生物试剂公司产品；RT－PCR反应试剂盒由日本Takara公司提供；Trizol裂解液由美国GIBCOBRL公司提供。 2 方　法 2．1 动物模型的建立与分组 60只大鼠中随机选取52只，按杨俊伟等单侧肾切除加STZ注射法改良复制DN模型。其余8只大鼠行左侧肾摘除假手术操作，然后按5mL／kg尾静脉注射pH4.4的柠檬酸缓冲液，作为正常对照组(F组)。将糖尿病肾病模型大鼠按性别、体重随机分为5组，每组8只，即绞股蓝皂苷高剂量组(A组：1g／kg)；中剂量组(B组：0.5g／kg)；低剂量组(C组：0.25g／kg)；人参皂苷Rbl组(D组：0.01mg／kg)；模型对照组(E组：灌胃等体积的生理盐水)。各组大鼠灌胃给药，每日1次，连续4周；正常对照组(F组)也灌胃等体积的生理盐水。 2．2　标本采集 各组大鼠于治疗第4周末以代谢笼留取24h尿液标本，用于测定尿蛋白；同时眼眶后静脉丛取血2－3mL，用于测空腹血糖、血肌酐、尿素氮(禁食不禁水12h)；然后全部颈椎脱臼处死，留取肾皮质，一半用于组织形态学化学检查，另一半用于RT－PCR。 2．3　检测指标 2．3．1　血糖与肾功能测定　血糖用葡萄糖氧化酶法测定，尿蛋白用考马斯亮蓝法测定，血肌酐、尿素氮均用日本日立7170型全自动生化仪测定。 2．3．2　肾脏病理组织学检查肾组织取材固定后。第3天更换10％中性甲醛溶液，1周后取出标本，进行修剪，然后冲水，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡后石蜡包埋。超薄切片机将肾组织切成3μm厚，供HE染色、PAS染色和免疫组织化学检查，光镜下观察肾组织病理形态学改变。 2．3．3　免疫组织化学检测肾组织TGF－β1的表达，采用ElivisionTMplus法，按试剂盒说明进行操作，显色剂为DAB。阳性结果判定：肾小球及肾小管间质区域见到淡黄色或棕黄色染色为阳性，应用真彩色病理图象分析系统软件进行。 2．3．4　RT－PCR检测TGF－β1。mRNA表达由基因库分别查得大鼠TGF－β1的mRNA核苷酸序列，Primer Premier计算机软件辅助引物设计，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，TGFβ1上下游引物分别为：5－ACGCAATCTATGACAAAACC－3和5－TACCAA