脑卒中及一氧化氮合成酶基因相关性及预防措施探究.docVIP

脑卒中及一氧化氮合成酶基因相关性及预防措施探究关于脑卒中基因水平的研究近年已经受到广泛的关注，人eNOS第7外显子C894T突变使编码的第298位谷氨酸(Glu)被天冬氨酸(Asp)所取代，使eNOS发生构象改变，从而引起eNOS活性降低，NO生成减少，从而减少了对脑血流的调节和神经细胞的保护作用，促进了脑卒中的发生。 我们采用候选基因病例对照的方法，以中国汉族脑卒中的患者，与年龄、性别相匹配的无脑卒中的高血压患者和健康人为研究对象，研究eNOS基因与脑卒中的相关性，旨在寻找预防脑卒中的措施，从分子水平提示脑卒中的发病机理，及早发现脑卒中的致病基因，为脑卒中的遗传学发病基础研究及早期预警提供线索，避免脑卒中发病造成的死亡和重度致残。 资料与方法 研究对象与分组：临床共观察脑卒中病人300例，与脑卒中患者年龄性别匹配的健康人300例。汉族，无血缘关系。其中男190例(占63.33％)，女110例(占36.67％)，男女比例为1.60：1；病例组平均年龄为61.34，对照组的平均年龄61.03，差异无统计学意义(P=0.698)。而腰臀比、体质指数及有无高血压、糖尿病、冠心病及吸烟史等方面，具有统计学意义。 病例排除标准：排除痴呆、癫痫、肾功能不全(血清肌酐＞132mnoL／l及≥2mg／dl，和／或蛋白尿血尿)及肝功能不全(ALT≥正常上限的2倍，或有肝性脑病、肝硬化、食道静脉曲张或门静脉分流史)，甲状腺功能亢进或低下，慢性阻塞性肺病。有恶性肿瘤史(包括白血病或淋巴瘤)，有自身免疫性疾病。病人不同意参加本研究者。 研究方法：①病例组：询问高血压病史、吸烟、饮酒史。进行CT或MIR检查。抽血检查血尿常规、肝、肾功能、血脂检查。②对照组：同上。 两组抽取静脉血5～6ml进行分子生物学试验，步骤如下：从白细胞中提取DNA(采用酚-氯仿法)。①进行DNA鉴定、定量。②用PCR扩增eNOS基因。③PCR扩增产物进行酶切(RFLP)。④对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。⑤显示电泳条带。⑥选择不同基因型的PCR产物各3个标本DNA片段纯化吸收。对PCR产物进行克隆。并进行DNA测序。 观测指标：①eNOS基因型及等位基因在脑卒中组和对照组中的分布。②eNOS基因型与脑卒中关系。③eNOS基因型、WHR、BMI、高血压病史、吸烟、饮酒、体育锻炼等是否具有协同效应。 统计学方法：采用X2检验和t检验比较脑卒中组与健康人组。X2检验对基因Hardy-Weinberg平衡检验。计算OR值。采用Logistic多元回归分析基因多态性及其他危险因素对脑卒中的作用。同时应用X2检验比较环境因素(吸烟)与基因之间是否存在交互作用。所有统计学处理应用SPSS8.0软件进行处理。 结果 基因型分布：病例组：等位基因G的频率87.75％，等位基因T的频率12.25％；对照组：等位基因G的频率90.89％，等位基因T的频率9.11％。OR值为1.570，P为0.016，T等位基因频率脑卒中组显著于对照组。 同时可见以GG基因型为参照，分析TT、GT和GT+TT基因型与脑卒中发病的关系，可见携带至少一个T等位基因的基因型个体患脑卒中的风险为携带GG基因型者的1.524倍。以多元逐步条件logistic回归分析，调整吸烟、饮酒、体制指数、腰臀比、高血压病史等因素的影响后，eNOS Gg94T变异对脑卒中仍具有影响，OR为2.165。 讨论 脑卒中已成为人类的主要”杀手”之一。我国脑卒中每年新发生病例约150万，其中80％是缺血性脑卒中，严重影响人民的生命和生活质量。因此，从分子水平深入研究脑卒中的发病机制具有重要意义。一氧化氮(NO)主要由内皮型(eNOS)调节，其在抗动脉粥样硬化及脑血流调节中起关键性作用，并最终影响梗死面积。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化L-精氨酸生成NO和瓜氨酸。内皮细胞生成的NO可促进血管平滑肌细胞舒张，抑制血管内皮表面血小板和白细胞的粘附与聚集，防止低密度脂蛋白氧化。抑制血管平滑肌细胞增生，对血管收缩因子如内皮素及血管紧张素具有抑制作用，因此是血管AS过程重要的抑制因子。 迄今为止已有大量的研究探讨了eNOS基因多态性与冠心病、脑卒中的关系，但所得结论不一。人eNOS含有1203个氨基酸，其基因为单拷贝，定位于染色体7q352q36，全长21-22kb，包括26个外显子和25个内含子。第7外显子G894T突变使编码的第298位谷氨酸(Glu，等位基因G)被天门冬氨酸(Asp，等位基因T)所取代，使eNOS发生构象改变，从而引起eNO s活性降低，NO生成减少。 Elbaz等对法国12个中心460例脑卒中患者及460例年龄、性别相匹配的健康对照者研究后发现，eNO