神经干细胞体外培养研究进展.docVIP

*神经干细胞体外培养研究进展 罗湘颖1.2.杨志敏2.王廷华1.赵匡彦2. 冯忠堂1. (1. 昆明医学院神经科学研究所2. 昆明医学院附属第一医院神经外科，云南 昆明 650031) 近年来，随着神经科学的迅猛发展，神经科学界不但摆脱了哺乳动物中枢神经系统神经元损伤后不可再生的传统观念的桎梏，接受了神经干细胞的概念，而且已经将神经干细胞应用于体内、外各种实验研究。鉴于体外培养方法在神经干细胞研究中的特殊的重要性，本文将就这一方面的研究进展做一综述。 1. 神经干细胞概念的提出 干细胞(stem cell) 是指具有自我复制能力、能够分化成为至少一种功能细胞的早期未分化细胞。根据干细胞分化潜能的大小,可分为全能干细胞、多能干细胞以及只能向一种细胞类型分化的单能干细胞。神经干细胞选择性培养法的建立是人们认识神经干细胞的起点，是推动神经干细胞生物学发展的一大动力。1992年，Reynolds等[1]首先利用一种称为“neurosphere法”的特殊体外培养方法分离成年鼠的纹状体组织，酶解后加入表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）体外培养，获得了神经球干细胞，这些聚集成神经球(neurosphere)的培养细胞具有自我更新和增殖能力，表达神经上皮干细胞标记巢蛋白(neuroepithelial stem cell protein，nestin)，并在体外培养诱导时可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。Reynolds等从而据此提出来神经干细胞（neural stem cell，NSC）这一概念。神经干细胞属于多能干细胞，在一定微环境中可分化出神经元和胶质细胞。神经干细胞至少具备3种特性[2]：（1）缺乏神经系统分化的标志，是一种具有分化潜能的原始细胞；（2）具有自我更新和增殖能力；（3）多潜能性，即在特定条件影响或诱导下能分化为神经元和神经胶质细胞。 2. 体外培养神经干细胞的来源 目前，体外培养神经干细胞的来源主要有以下几个方面[3]：（1）从成体组织或胚胎组织分离；(2) 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）的定向诱导；（3）用癌基因如V-myc等转化神经细胞获得永生化细胞系。 胚胎干细胞具有分化的全能性，通过改变其培养基成分可定向诱导为某一专能干细胞。但其中人胚胎干细胞的应用受到伦理及法律的限制。而应用病毒或V-myc等癌基因修饰的永生化细胞，其遗传特性改变并有继续突变的趋势，可能在移植后生成肿瘤或在分析正常基因对子代细胞分化方向时产生影响，因而其应用亦不广泛。所以目前进行的神经干细胞研究，一般多是从胚胎组织或成体组织取材。 经过十余年的研究，现已发现哺乳类胚胎中，NSCs集中在嗅球、侧脑室的脑室区、室下区、海马、脊髓、后脑和脑皮层。而在成年啮齿类动物和成人的脑中则有三个NSCs群，一个位于脑室区和室下区(subven-tricularzone，SVZ)，这两个区域的室管膜细胞是由神经母细胞组成的混合细胞群，它们可以迁移到嗅球产生前体细胞（precursorcell）、星形细胞；另一个在连接侧脑室和嗅球的区域(在成人尚未得到证实)；第三个是海马[4]。另外，继成年哺乳动物脑内成功地分离到了神经干细胞后，1996年Weiss等[5]首次报道成功地从成年哺乳动物脊髓内分离到了神经干细胞。 此外，在神经干细胞长期培养过程中，现已明确中枢神经系统的神经干细胞来源于囊胚期的内细胞群，至少分两类，即神经上皮干细胞和神经球干细胞，前者依赖碱性成纤维生长因子(fibroblast growth factor，FGF)发育分化，后者依赖EGF发育分化。起源于纹状体和皮层的干细胞，既可以在EGF的刺激下分裂增殖，又可以在FGF的刺激下分裂增殖，但EGF反应性和FGF反应性干细胞可能分属于干细胞的不同群组。从中枢神经系统的头端向尾端过渡，脑干源的神经干细胞已经发现对EGF的反应性下降，到了脊髓，基本就丧失了对单独的EGF的反应能力，只对FGF的刺激有反应，甚而只有在EGF和FGF的协同作用下才能长出能够分裂传代的功能性神经干细胞[6]。 3. 体外培养神经干细胞的方法 3.1成体组织及胚胎组织神经干细胞的培养方法 最先培养成功成年大鼠纹状体组织神经干细胞以及成年大鼠脊髓组织神经干细胞的Reynolds[1]和Weiss[5]所采用的培养方法基本一致：组织取材后酶解消化，然后转入含0.7?mg/ml 卵粘蛋白的DMEM/F12(1:1)液中机械吹散，将细胞悬液400转高速冷冻离心5分钟，再将沉淀洗涤一次后用培养基悬浮细胞，调整活细胞浓度为5000－10,000 个/ml，置于未包被的培养皿中培养。培养基的配方为：DMEM/F12(1:1)为基础培养基，包含5?mM HEPES，0.6%葡