玉米弯孢叶斑病菌clt-1基因生物信息学分析和启动子的功能鉴定.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３７（３）：３７４２ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 玉米弯孢叶斑病菌ｃｌｔ１基因生物信息学分析和 启动子的功能鉴定 １，２ １，２ １，２ １，２ １，２ １，２ 倪　璇 　高金欣 　余传金 　刘　铜 　李雅乾 　陈　捷 （１上海交通大学农业与生物学院　农业部都市农业（南方）重点开放实验室　上海　２００２４０） （２上海交通大学　国家微生物代谢重点实验室　上海　２００２４０） 摘要　利用农杆菌介导的基因转化（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＡＴＭＴ）技术构建玉米 弯孢叶斑病菌突变体库，并从中筛选到了一个毒素合成相关基因ｃｌｔ１。对ｃｌｔ１基因编码的蛋白质 进行生物信息学分析，结果表明ＣＬＴ１的分子质量为８１．９８４８ｋＤａ，等电点ｐＩ为８．６２，不稳定指数为 ５５．０８；ＣＬＴ１是亲水性蛋白，包含１个膜外区域。在亚细胞水平上，ＣＬＴ１定位于细胞核内；在氨基酸序 列方面，ＣＬＴ１含有多个苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸激酶磷酸化位点；在功能方面，ＣＬＴ１包含ＢＴＢ特征结构 域，可能参与一些功能蛋白质活性的调控。利用ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）基因作为报告基因，构建了 用于鉴定ｃｌｔ１基因启动子活性的ｐＣ１３００ｔｈＰｃｌｔ１ＧＦＰ真菌表达载体，采用ＡＴＭＴ方法转化弯孢菌萌发的 分生孢子，通过ＰＣＲ及ＧＦＰ荧光检测ｃｌｔ１基因启动子在弯孢菌中调控 ＧＦＰ基因表达的活性。结果表 明，在共聚焦激光扫描显微镜下观察到菌丝和孢子发绿色荧光，说明弯孢菌ｃｌｔ１基因启动子具有较强驱 动外源ｇｆｐ基因表达的活性。 关键词　玉米弯孢叶斑病菌　生物信息学　启动子活性　ｃｌｔ１ＧＦＰ 中图分类号　Ｑ８１１．４ 　　由新月弯孢［Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａ（Ｗａｋｋｅｒ）Ｂｏｅｄｉｊｎ］ 米弯孢叶斑病菌突变株体系，筛选致病性差异变化较 引起的玉米弯孢叶斑病（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａｌｅａｆｓｐｏｔ）是玉米叶 大的突变株，研究其生物学特性和致病相关因子活性变 部发生的一种真菌性病害，其分布广泛，属于世界范围 化，发现Ｔ８０６丧失了产生非寄主专化性毒素甲基５（羟 ［１］ 甲基）呋喃２羧酸的能力。通过巢式 ＰＣＲ扩增得到 的病害 。玉米弯孢叶斑病是继玉米大斑病、玉米小 斑病和玉米圆斑病之后，在我国出现的又一个严重的 了标记基因ｃｌｔ１，发现 ＡＴＭＴ插入破坏了该基因的启 ［２］ ［６］ 灾害性病害 。该病害一旦发生会迅速蔓延，病斑较 动子 。本文对ｃｌｔ１基因进行了生物信息学分析，并 密集，对生产造成严重威胁。 且对启动子活性进行了鉴定，为进一步研究玉米弯孢 　　目前，玉米弯孢叶斑病菌的致病机制研究主要集 叶斑病菌毒素合成及致病机制奠定了基础。 中在流行规律、种质资源抗病性及遗传分析、病原菌的 １　材料与方法 ［３５］ 生物学特性及致病性分化等方面 ，但对其致病分子 １．１　材料、仪器设备 机制方面的研究尚不深入。因此，开展玉米弯孢叶斑 １．１．１　菌株与质粒　ＣｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａＣＸ３（野生 病菌致病相关基因的鉴定与功能分析，对揭示该病菌 型）为强致病性菌株：大肠杆菌菌株ＤＨ５ 作为感受态