血清脂蛋白和血清脂蛋白电泳pdf.PDF

【名称】血清脂蛋白和血清脂蛋白电泳 【英文名】serum lipoprotein electrophoresis 【别名】 【概述】 脂蛋白电泳主要用于高脂蛋白血症分型，也有助于了解冠心病的血脂状 态，更好地指导临床诊疗工作。 【原理】 脂蛋白是在碱性 pH条件下，以琼脂糖凝胶或醋酸纤维条带作为载体，从 阳性方向来进行分离的。形成的蛋白区带可以用脂肪染料如苏丹黑或者油红染 色，它们只用于脂蛋白染色。在琼脂中可能会有附加的聚阴离子和二价阳离子 沉淀。脂蛋白沉淀带用光密度计可立即定量分析。脂蛋白区带也可以被切开后 重新溶解，对各区带进行胆固醇浓度的直接酶法检测。另外，有报道在用薄层 琼脂糖凝胶上进行电泳分离后，可直接检测各脂蛋白组分中的胆固醇含量的方 法。 【试剂】 (1)巴比妥-巴比妥钠缓冲液 (pH 8.6±0.1、μ＝0.06)：以巴比妥2.21g、 巴比妥钠 12.36g于500ml蒸馏水中，加热溶解，待冷却至室温后加蒸馏水至 1000ml。 (2)染色液： ①丽春红 S 染色液：丽春红9.04g、三氯醋酸 6g，用蒸馏水溶解，并稀释 至100ml。 ②氨基黑 10B染色液：氨基黑 10B 0.1g，溶于无水乙醇 20ml中，加冰醋 酸5ml，甘油 0.5ml 使溶解。然后将磺柳酸2.5g，溶于少量蒸馏水中，加入前 液，再以蒸馏水补足至 100ml。 (3)漂洗液： ①30ml/L醋酸溶液：用于丽春红染色的漂洗。 ② 甲醇45m，冰醋酸 5ml和蒸馏水 50ml混匀。用于氨基黑 10B染色的漂 洗。 H
Na O ·2H O)21g 和N-甲基-吡咯烷酮 150g，用蒸馏 (4)透明液：柠檬酸(C 水溶解，并稀释到 500ml。亦可选用氢萘或液体石蜡透明。 (5)0.4mol/L氢氧化钠溶液或 0.1mol/L氢氧化钠溶液。 【操作方法】 (1)将缓冲液加入电泳槽内，调节两侧槽内的缓冲液，使其处于同一平面 。 (2)醋酸纤维素薄膜 的准备 ：取醋酸纤维素薄膜 (2cm×8cm)在毛面的一端 (负极侧)1.5cm处用铅笔轻划一横线，做点样标记 。编号，并标 明正、负极 后，将薄膜置于巴比妥-巴比妥钠缓冲液中浸泡，待充分浸透后 (一般为 20min) 取 ，夹于洁净滤纸中间吸去多余的缓冲液。 (3)将醋酸纤维素薄膜毛面 向上贴于电泳槽支架上拉直。用微量吸管吸取无 溶血血清 3～5μl于横线处沿横线加样，样品应与薄膜 的边缘保持一定的距 离，以免 电泳图谱中的蛋白区带变形，待血清渗入薄膜后，反转薄膜，使光面 朝上，平直地贴于电泳槽支架上，用双层滤纸或四层纱布将薄膜 的两端与缓冲 液连通，稍待片刻。 (4)接通 电源 ，注意醋酸纤维素薄膜上的正、负极，切勿接错 。电压 90～ 150V ，电流 0.4～0.6mA/cm(不同的电泳仪所需 电压，电流可能不同，应灵活掌 握)，夏季通 电45min，冬季通 电时间稍长，约为 60min，电泳区带展开约 25～ 35mm即可。 (5)染色：通 电完毕，取下薄膜直接浸于丽春红 S 染液或氨基黑 10B染色液 中，染色 5～10min(以白蛋白区带染透为止)，然后在漂洗液中漂去剩余染料， 直至背景无色为止 。 (6)定量： ①比色法：将漂洗的薄膜吸干，剪下各染色的蛋白区带入相应的试管 中， 在白蛋白管中加 0.4mol/L氢氧化钠 6ml(计算时吸光度乘 以2)，其余各管加 3ml，振摇数次，置 37℃水箱 20min 使其色泽浸 。氨基黑 10B染色用分光光 度计在 620nm 处读取各管吸光度，然后计算 各管的含量(同时做空白管对 照)。 丽春红 S 染色时浸 液用 0.1mol/L氢氧化钠，加入量同上法。10min后， 白蛋白管 内加400ml/L醋酸 0.6ml(计算吸光度时乘以2)，其余各管加 0.3ml， 以中和部分氢氧化钠，使色泽加深，必要时离心，取上清液用分光光度计在 520nm 处读取各管的吸光度(同时作空 白对照)，然后计算各 自的含量。 ②光密度计扫描法：A.透明：吸去薄膜上的漂洗液 (为防止透明液被稀释影 响透明结果)，将薄膜浸入透明液中 2～3min，然