胰高血糖素样多肽-2的重组表达及鉴定.docVIP

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胰高血糖素样多肽-2的重组表达及鉴定.doc

胰高血糖素样多肽-2的重组表达及鉴定 陈渝 赵云 摘要:目的 构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化获得高纯度的为的作用机制的探究奠定基础。转化至进行诱导表达,优化条件获得最大表达产量;纯化重组蛋白,SDS、Western blot 鉴定重组蛋白结果Construction of Glucagons like peptide 2 prokaryotic expression vector and expression of Glucagons like peptide 2 gene Abstract: Objective To construct prokaryotic expression vector of GLP-2, express and purify the recombinant GLP-2 in E.coli BLR(DE3), the research establish the base for further study physiological and pharmaceutical function of GLP-2. Methods GLP-2 DNA fragment was synthesis useing chemistry method , and the gene was cloned into prokaryotic expression vector pET31b(+), gained the recombinant expression vector GLP-2/pET31b(+).After identified by DNA sequencing,The recombinant plasmid GLP-2/pET31b(+) was transformed into E.coli BLR(DE3). After IPTG induction, the expressed protein products were verified by SDS - PAGE and Western blotting, purified by Ni2 +- NTA agarose affinity chromatography and desalinization by molecular sieve . the final GLP-2 monomer was gained by clearaged of bromide hydrogen .Result gene sequencing proved that the fragment amplified was inserted into prokaryotic expression vector pET31b(+)correctly. Tricine SDSanalysis and Western blotting showed that the proteins have good antigenicity and specificity. Conclusion Successfully constructed GLP-2/pET31b(+) prokaryotic expression vector, expressed recombinant GLP-2 in E.coli BLR(DE3), and achieved high purity recombinant GLP-2 protein monomer. 【关键词】:胰高血糖素样多肽-2;原核表达;肠道保护;烧伤;缺氧;细胞增殖 严重烧伤后造成肠粘膜血流量下降,肠粘膜组织损伤及通透性增加,使肠道屏障功能障碍, 造成肠道细菌移位,引发多器官功能障碍,是导致伤后高代谢的重要原因。因此促进严重烧伤后肠道修复,能减轻脏器炎症反应,防止肠源性感染,改善代谢障碍,加快创面愈合,是临床救治重要措施之一。肠道作为人体最大的内分泌器官,其自身分泌许多肠道激素对肠道结构功能起着重要的保护作用,随着近年来对胰高血糖素样多肽-2(Glucagons like peptide 2,GLP-2)认识的不断深入,发现其对肠道有特异性保护作用。且有广泛临床应用前景。 本研究利用基因重组技术设计构建了GLP-2原核表达载体并诱导表达,初步观察其对烧伤后大鼠肠道及肠上皮细胞的保护作用,利用体外细胞模型,探讨GLP-2促细胞增殖的作用机制及调控因素,为今后临床应用提供理论依据。 材料与方法 1.1菌种与试剂 AlwN I 酶切, 去磷酸化的质粒pET-31b(+)购于美国Novagen公司;感受态细菌DH5α(本所保存菌种); BLR(DE3)购于美国Novagen公司;Bugbuster-His.Bind 纯化试

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