三七总皂苷对铝暴露体外血脑屏障通透性影响1.doc

三七总皂苷对铝暴露体外血脑屏障通透性影响1 摘要：目的 探讨三七总皂苷对铝暴露下血脑屏障功能的影响，初步揭示三七总皂苷拮抗铝神经毒性，防治阿尔茨海默病的可能机制及靶点。方法 采用细胞插入器培养单层脑微血管内皮细胞Balb/c，建立体外血脑屏障模型。铝暴露24 h后，通过跨内皮细胞电阻（TEER）和辣根过氧化物酶（HRP）透过率的变化，观察三七总皂苷对铝暴露血脑屏障通透性的影响。结果 三七总皂苷能够提高TEER值，降低HRP透过率。其中，以高剂量组作用最为显著，与模型组比较差异显著（P 0.15 cm 。4 h 后若仍能保持明显的液面差，为试漏实验阳性。 1.2.2.2 跨内皮细胞电阻测定 室温下弃培养液，0.1 mol/L PBS洗涤3次，每次5 min，将插入器置于0.01 mol/L 的PBS中，用Millicell膜电位仪测电阻，减去基础电阻后除以PET膜的底面积，即为实际的TEER(Ω/cm2)。 1.2.2.3 辣根过氧化物酶透过率 待4 h 液面试漏实验阳性时，弃去插入器原有的内皮细胞培养基，然后在供池中加入含有HRP 500 ng的通透性试验用培养基，受池中加入相同培养基1140 μL，使细胞插入器内外液面相平，于培养即刻、0.5 h、1 h、2 h、4 h 从受池中各取样50 μL，每孔加入四甲基联苯胺溶液和H2O2 溶液各50 μL，显色10 min，以1 mol/L的H2SO4 50 μL终止反应，用酶标仪在450 nm 处测定吸光度(A)值。另取HRP 10 ng/mL，用无血清DMEM培养基倍比稀释，同法显色并测定A值，绘制浓度对应A值的标准曲线。根据各个样品测得的A值，利用标准曲线计算各组细胞HRP通透率。 1.3 实验分组 选择试漏实验阳性的孔进行分组，共分为6组：正常对照组（DMEM培养基）；模型组（培养基中含除125 μg/ml AlCl3外，还分别含三七总皂苷25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL）；阳性对照组（培养基中含125 μg/mL AlCl3和铝螯合剂30 μg/mL）。每组设3个复孔，在培养条件为37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。 2 结 果 2.1 脑微血管内皮细胞的培养 Balb/c复苏16 h后于倒置显微镜下观察，可见细胞散在分布，胞体肥厚、透明，呈梭形、多角形，核小而圆。培养48 h～72 h细胞单层生长，呈铺路石样，85%以上融合。 2.2 体外BBB模型建立 2.2.1 液面试漏实验 均匀接种在24孔细胞插入器中的脑微血管内皮细胞，培养3 d后试漏实验阳性，初步认为BBB 模型形成。 2.2.2 TEER测定 TEER 值在第3天较第2天有显著性增加（P0.01），同时该TEER 值可持续3 d以上。 2.2.3 HRP透过率 实验结束当天，加入含HRP 的培养基，2 h 透过率 1%。综合结果，可判定体外BBB 模型已形成。 2.3 三七总皂苷对铝暴露下BBB通透性的影响 铝暴露可显著降低BBB 的TEER，同时，明显增加HRP 透过率，与正常对照组相比（P0.01）。三七总皂苷高剂量组和铝螯合剂组可明显改善铝暴露对BBB 造成的损伤，提高TEER，降低跨内皮细胞通透性，与模型组比较差异显著（P0.05）；但两组的HRP 透过率仍显著高于正常对照组（P0.05）。三七总皂苷低、中剂量组虽对BBB的TEER和HRP 透过率有一定的改善作用，但与模型组之间的差异不显著。详见表1。 表1 三七总皂苷对TEER值和HRP 透过率的影响（x±s） 3 讨 论 BBB是循环系统和中枢神经系统之间的一个复杂的动态调节界面，是物质进入脑组织的重要屏障，可阻止血浆中的毒性及过量物质进入脑内，保证了中枢神经系统所需内环境的高度稳定［5］。脑微血管内皮细胞是BBB的基本骨架，具有适应其功能的结构特点，细胞间还有紧密连接，并且有较高的跨细胞电阻，是BBB发挥屏障功能的核心成分［14］。因此，本实验中采用单层脑微血管内皮细胞培养，建立BBB模型，在4 h 液面试漏实验的基础上，以TEER 和HRP 透过率作为模型成功的评价指标。结果显示，BBB模型在第3天试漏实验阳性，同时，TEER达到峰值，2 h HRP透过率 1%，说明已形成致密的紧密连接，模型建立成功。 铝是一种具有神经毒性的元素，可通过慢性蓄积作用于中枢神经系统，在脑内产生与AD类似的病理改变，可以引起动物脑内引起tau蛋白和Aβ的沉积，神经元纤维变性及神经元纤维缠结，同时还可改变降解淀粉样蛋白的酶，最终导致神经元的凋亡及坏死［15］。而铝跨越BBB及对BBB的影响是铝引发脑内一系列病理生理改变的核心和基础［8］。脑微血