生物显微镜技术5分子生物学技术.ppt

第五章 ??分子生物学技术 当今，几乎所有的涉及生命的分支学科均已被分子生物学渗透，近10年来，在生命学科的研究中取得了令人瞩目的丰硕成果，特别是在肿瘤、艾滋病、心血管系统疾病，遗传性疾病等方面，均取得了一些突破性进展。 在形态学上展示分子水平的各种变化，将组织和细胞的形态学改变和基因、蛋白质的无穷变化有机地联系起来，必将开创病理学研究的新天地，对疾病的病因学、发病学以及形态学等诸方面做出更大的应有的贡献。 第一节??原位核酸分子杂交技术 原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。 这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，为从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。 原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图、转基因检测、基因表达定位、核DNA和RNA的mRNA的排列和运输、复制和细胞的分类。 临床研究应用在细胞遗传学、产前诊断、肿瘤和传染性疾病的诊断、生物学剂量测定、病毒学的病原学诊断等。 原位杂交技术最早应用于60年代末期 1975年较为系统地在细胞内进行原位杂交的技术。 80年代中后期，常规福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片中进行简便易行的原位杂交 原位杂交技术包括有： 菌落原位杂交（colony in situ hybridization） 斑点杂交法（Dot blot） Southern印迹杂交（Southern blot） Northern印迹杂交（Northern blot） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization） 基因组原位杂交（Genome in situ hybridization) 。 一、核酸原位杂交的基本原理 核酸分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度和离子强度等）可按碱基互补原则退火（annealling）形成双链的过程。这一杂交过程具有高度的特异性。 杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测的核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。将核酸从细胞中分离纯化后可以在体外与探针杂交（膜上印迹杂交），也可以直接在细胞内进行（原位杂交）。 用于检测的已知核酸片段称之为探针（probe）。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。 常用的标记物包括放射性同位素和非放射性物质两大类。 原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此，对那些细胞数量少而散在分布于其他组织中的细胞内DNA或RNA的研究更为方便。 原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保护组织和细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态 二、核酸原位杂交的主要过程 核酸原位杂交按检测物的不同，分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交。 根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA杂交。 但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。 （一）组织细胞的固定 适宜核酸杂交的理想的固定液应具备下列特点：1.能很好地保护组织细胞的形态。2.对核酸无抽提、修饰与降解作用。3.不改变核酸在细胞内的定位。4.对核酸与探针的杂交过程无阻碍作用。5.对杂交信号无遮蔽作用。6.理化性质稳定、价格低廉。 最常用多聚甲醛固定组织 醋酸、酒精的混合液和Bouin’s固定剂也能获得较满意的效果 组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10 min，空气干燥后保存在-70℃。 （二）预杂交 目的是去除核酸表面的蛋白质，以利核酸探针对靶核酸进行杂交。 常用去垢剂（detergeat）和/或蛋白酶对组织细胞进行部分的消化酶解以去除核酸表面的蛋白质。 常用的去垢剂有Triton-X100和十二烷基硫酸钠（SDS） 常用的蛋白酶有蛋白酶K等。 蛋白酶K的纯度、浓度、消化的时间在不同的组织细胞中相差极大，因此，必须进行一系列的预试验，找到适当的浓度及消化时间。 一般应用蛋白酶K 1μg/ml(于0.1 mol/L Tris/50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中)，37℃孵育15~20 min (三) 杂交 1、探针的选择 其长度为50-300bp（碱基）最好 （1）双链DNA探针。（2）人工合成