动(植)物疫病防制高技术原理与方法修改稿.docVIP

第一章病原基因诊断新技术之一——核酸探针技术 一、引言核酸探针技术是80年代发展起来的一项全新的疾病诊断技术，其基本原理是利用与病原基因组序列互补的一段核酸(单链DNA或RNA)，标记上能高敏感度被检测的一种物质如放射性同位素或酶，由此制备的核酸探针对病原进行特异性(探针核酸序列与病原基因组同源序列特异性互补)和敏感性(放射性同位素等标记物质)的检测。由于它是对病原生命最基本的物质—核酸进行直接检测，与检测核酸编码的蛋白质的免疫学方法不同，因此越来越受到广泛应用，包括从临床样品中准确地检出微量病原的DNA或RNA，尤其是对那些生长条件要求苛刻、培养困难的病原；鉴别强弱毒株或疫苗株与野毒株；微生物的分型；病原基因图谱分析；筛选特定基因DNA文库；研究疾病发生机制；流行病学调查等方面。 随着各种非放射性标记技术的引入和不断完善，核酸探针技术亦步入临床实用阶段，并逐步走向产业化。目前世界上已有多种医学用核酸探针上市销售，据统计，1989年美国的销售额为1380万美元，估计1994年可高达3亿美元。我国在人用和兽医核酸探针的研究中都取得了显著进展，几乎对每一种病原包括病毒、细菌等都进行了核酸探针研究。但我国研制的核酸探针实用化程度不够，多处于实验室研究阶段。尽管如此，核酸探针技术在我国已充分显示出了具有实际应用的前景。 核酸探针技术通常是将一个已知顺序的单链核酸片段加以标记作为核酸探针，用来检测标本核酸中是否具有互补的碱基顺序。样品核酸常被固定于固相介质中而与溶液中的探针进行分子杂交，如两者有互补顺序则杂交成功，结果为阳性，反之则为阴性。因此，分子杂交涉及到单链探针和样品核酸两个因素。被检测基因常存在于某种组分的内部，需要将核酸分离出来或经去蛋白处理，然后用热或碱处理使其变为单链并固定在一介质中以便作杂交检测。而单链探针可以通过多种方法制备，探针的核苷酸顺序则是依据病原体的基因组而设计的。核酸探针技术的基本过程是：①制备探针DNA，进行标记；②制备样品DNA，转移至膜；③预杂交、分子杂交、洗膜；④显示结果。 二、探针核酸的制备 任何形式的核酸(DNA、RNA)适当标记后均可作为探针。因此，核酸探针的制备过程中，首先要获得用以制备探针的核酸。通常有以下几种方法。 全基因组DNA 这种方法较简单，主要用于病毒探针核酸的制备。纯化病毒、提取核酸、酶切后或不酶切直接标记制备探针。但要取得较多量的原材料特别是病毒比较困难。 2. cDNA 首先提取纯度较高的相应的mRNA，若是RNA病毒则提取病毒核酸，然后反转录成cDNA，利用cDNA与目的基因互补的特性将其作为探针，标记后的探针叫做cDNA探针。 反转录得到的cDNA还可以经过修饰，比如在末端加上接头或poly(dG)/poly(dC)等，克隆到质粒载体中，然后转化大肠杆菌，筛选携带有目的基因的克隆。经过扩增后，就可以从重组质粒中获取大量的cDNA用以制备探针。 3. 基因组克隆 提取病毒、细菌等的基因组核酸，用超声波随机打断或用限制性内切酶进行水解，得到许多随机片段。选取长度在300bp以上的片段重组到质粒或λ噬菌体中，转化或转染大肠杆菌，在固体培养基中得到大量菌落或噬菌斑，然后利用原位杂交方法筛选含目的基因的克隆。从这些基因组文库中调取克隆，扩增后提取目的基因即可用于制备探针。 制备cDNA和基因组克隆的方法参见《Molecular cloning》，用这种方法可以无限制地扩增制备大量探针，这对于疫病的诊断相当有利，可收到一劳永逸的效果。 4. 化学合成DNA 目前DNA/RNA合成仪的普遍使用，使探针的制备极为方便。用合成仪可以合成50个核苷酸以内的任意序列的寡核苷酸片段作为探针，合成的探针核酸也可以克隆到M13或SP6系统中，以便能获得大量的用以制备探针单链DNA或RNA。 5. PCR扩增片段 聚合酶链式反应(PCR)基因扩增法在数小时内可使原始DNA扩增成百万倍，扩增的DNA即可用于标记制备核酸探针，方法简便、快捷。这种方法成功的关键在于设计恰当的引物以控制探针DNA的长度和特异性。(详见第二章) 6. 单链RNA 单链RNA探针的制备首先要依赖重组质粒，且它的克隆质粒必须含有T7或SP6RNA多聚酶启动子。 单链RNA探针的优点是在制备的过程中便可以被标记，即在T7或SP6RNA聚合酶的作用下和在4种核糖核酸的存在下(其中一种标有同位素或非同位素)，以特定的DNA(如病毒基因组DNA或RNA的逆转录产物cDNA)为模板，在体外转录含有标记物的单链RNA探针。 单链RNA探针的独特之处首先在于它的单链特性，与DNA探针相比，具有下述特点：①制备简单。单链RNA探针的制备不需要凝胶过滤分离步骤，经转录只产生带标记物的单链RNA，模板DNA可通过加入无RNase的DNase除去；②标