温度控制对培养流感病毒细胞影响.docVIP

温度控制对培养流感病毒细胞影响从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体内外进行培养，使之生存和生长，称之为组织培养［1］。因近来发现，用组织培养细胞所分离到的流感病毒，其抗原性和基因特性要比用鸡胚分离到的更接近原始采集的标本，故世界卫生组织号召大家寻找合适的细胞来制备流感病毒疫苗，来代替鸡胚制备疫苗［2］。 资料与方法 材料：生长成片的MDCK细胞。T-75细胞培养瓶，颈口有倾角。D-MEM培养液：青、链霉素母液(10?000U/ml青霉素G；10?000μg/ml硫酸链霉素)，分装后保存于-20℃。HEPES缓冲液，1M母液。胎牛血清，40nm滤过。EDTA-胰酶(0?05%胰酶；0?53mM EDTA 4Na)，分装后保存于-20℃，牛血清白蛋白组分V，7?5%溶液。1ml、10ml无菌移液管。70%～75%的酒精。待测毒株：红细胞悬液(鸡、豚鼠，由于“O”相毒株不能凝集鸡红细胞，所以在对该类病毒进行鉴定时应使用豚鼠红细胞)。磷酸缓冲液(PBS)，0?01M，pH 7?4(Sigma P 3813)。多道及单道可调加样器单通道可调加样器量程20～200μl、200～1000μl，8通道或12道可调加样器量程20～200μl。孔微量板：鸡红细胞选择“V”型或“U”型底微量板；豚鼠红细胞选择“U”型底微量板。其他耗材，200μl、1000μl滴头、试管、加样槽等。 方法：①细胞的传代：这里以T-25细胞瓶单层培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。用于细胞培养的培养基、胰酶等，37℃回温后，用70%～75%酒精擦拭后放于生物安全柜内［3］。弃培养液，加1ml预先37℃温浴的EDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料表面分离(5～10分钟)。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。加10ml完全型D-MEM，轻轻上下移动移液管来分散细胞团。一般情况下，1瓶细胞传3瓶，每2～3天需传1代。②MDCK细胞保存及复苏：MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加而下降，故各实验室应液氮冻存代数较低的细胞作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和90%小牛血清。首先进行细胞消化，消化过程同细胞培养的消化。细胞消化后，加入配置好的细胞冻存液，混匀后分装到细胞冻存管内。细胞冻存浓度1×106。MDCK细胞保存：将单层细胞消化分散成为单细胞，加入0?9ml小牛血清和0?1ml二甲基亚砜混合保存液，每瓶加1ml保存液，缓慢冻存：先放4℃ 2小时，转放-70℃ 4小时，再转放液氮中长期保存。MDCK细胞复苏：将细胞生长液放入37℃回温，回温后以70%～75%的酒精擦拭，放入生物安全柜(无菌的操作台)内，自-70℃或液氮中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程盖子容易松掉，立即放入37℃水浴中快速解冻，轻轻摇动使其在1分钟内全部融化，以70%～75%的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜(无菌操作台)，取出1?0ml解冻的细胞悬液，缓慢加入有生长液的细胞培养瓶内，混合均匀，放入培养箱培养，次日更换细胞生长液。③红细胞凝集试验：根据所用的红细胞种类选用适当的微量板。将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第1列；平行方向称行，如A1～A12称为A行。标记好待检病毒的实验室编号及加样顺序。多道加样器装好200μl带滤芯滴头，于加样槽中吸取50μl PBS加入微量板的第2列，依次加入50μl PBS直至最后1列。加入待检病毒，单道加样器装好200μl带滤芯滴头，吸取100μl待检病毒液，加入已标记好的微量板的第1列相对应的孔内。最后的H1孔内加100μl PBS作为红细胞对照。多道加样器装好200μl带滤芯滴头，从第1列的各孔分别取50μl病毒液，加入到第2列的相应的各孔，混匀数次。依次从微量板的第2～12列做2倍系列稀释。最后1列每孔弃去50μl液体。多道加样器装好200μl带滤芯滴头，于加样槽中吸取50μl红细胞悬液。每孔加入50μl 1%的红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。室温孵育30～60分钟，观察红细胞凝集现象并记录结果。 结果判定：红细胞凝集滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。红细胞完全凝集以“+”记录；无凝集或部分凝集“-”记录。 结果 选择经不同温度保存后恢复正常生长状态的细胞与未曾改变生长温度的细胞，同时接种已知滴度流感病毒阳性毒株，3天后收获病毒液，检测病毒HA滴度，测试病毒培养效果，见表1。 讨论 在病毒分离实验中，由于病毒生长情况不确定，病毒传代的次数也不确定，因此对细胞的需求会经常发生变化，暂时不需要的细胞可以通过传代来保存，但频繁的传代不但会降低细胞的使用寿命，而且会产生的