201003003-15鼠李糖乳杆菌乳酸脱氢酶基因的克+隆及在大肠杆菌中的表达2.doc

鼠李糖乳杆菌D-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 摘要: 利用PCR的方法从鼠李糖乳杆菌基因组DNA中扩增到D-( + )-乳酸脱氢酶基因（ldhD），并连接到载体pSE380上，构建表达质粒pSE-ldhD，将重组质粒pSE-ldhD转化大肠杆菌BL21（DE3），重组菌株经IPTG诱导表达，SDS电泳分析表明ldhD在大肠杆菌中实现了表达，表达产物的分子量约为37KD。同时采用紫外分光光度法测定D-乳酸脱氢酶的酶活，测得重组菌株的D-乳酸脱氢酶活力为5.4U/ml。 关键词：D-( + )-乳酸脱氢酶，克隆，表达，鼠李糖乳杆菌 中图分类号:　　　文献标识码: A　　文章编号: Cloning of D-( + )-lactate dehydrogenase gene from Lactobacillus rhamnosus and expression in Escherichia coli Abstract: The gene ldhD encoding D-( + )-lactate dehydrogenase was amplified from genome DNA of Lactobacillus rhamnosus by PCR. The PCR product was ligated with the expression vector pSE380 after double-digested. A recombinant plasmid pSE-ldhD was constructed and transformed into E.coli BL21(DE3). The D-( + )-lactate dehydrogenase activity of recombinant strain was determined with spectrum assay after IPTG induction. Anlysed by SDSthe result showed that the cloned ldhD was expressed in the E.coli, and the relative molecular weight of the expression product was about 37 kD. The activity of D-(+)- lactate dehydrogenase of recombinant strain was 5.4 U/ml. Key words: D-( + )-lactate dehydrogenase; clone; expression; Lactobacillus rhamnosus 乳酸是一种重要的多用途有机酸，是世界公认的三大有机酸之一[1]。目前已广泛应用于食品、制药、化学工业以及环保等行业[2-3]。乳酸分子内含有一个不对称碳原子,因此具有旋光异构现象,区分为L-(+)-乳酸和D-(+)-乳酸。由于人体只有代谢L-乳酸的L-乳酸脱氢酶,因此在食用及药用等领域,L-乳酸的生产及应 用具有重要意义[4]；D-乳酸作为一个重要的手性中间体，已被用于多种手性物质的合成，近年来高光学纯度的D-乳酸因为在提高聚乳酸材料性能方面的实际应用而得到了更多的关注[5-6]。因此,高光学纯度的D-乳酸或L-乳酸均具有广阔的应用前景。 目前世界上产乳酸的菌种很多,但是产酸能力强,具有生产价值的主要是霉菌中的根霉及细菌中的乳杆菌属、链球菌属及芽孢杆菌属[7]。乳酸脱氢酶(LDH) 是以NADH为辅酶，将丙酮酸经过生化反应生成乳酸，因此LDH是乳酸菌合成乳酸的关键酶。自然界中的乳杆菌大部分存在L和D两种依赖NADH的LDH，分别催化丙酮酸生成L-乳酸和D-乳酸。如果利用基因工程手段敲除乳杆菌中的L-乳酸脱氢酶基因(ldhL) 或D-乳酸脱氢酶基因(ldhD)，则只生产高光学纯度的D-乳酸或L-乳酸，同时可以大幅提高相应的产量。Kyla-Nikkila等利用基因替代的方式缺失了Lactobacillus helveticus CNRZ32的ldhD基因，构建了两株基因重组菌，这两株菌都只生产L-乳酸，且L-LDH的活性均有很大的提高[8]。 本文利用PCR技术从鼠李糖乳杆菌基因组中成功获得D-乳酸脱氢酶基因ldhD，并将其连接至表达载体pSE380上，导入表达宿主BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，在大肠杆菌中实现了表达，为下一步构建D-乳酸脱氢酶缺陷型基因工程菌的研究奠定了基础。 1 材料与方法 1.1材料 1.1.1 菌株和质粒 鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus 1553购自日本JCM菌种保藏管理中心；大肠杆菌DH5α和BL