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菌种改造技术 摘要：微生物在工业上的应用日益增多，而一般从自然中得到的微生物产率都不高，达不到生产要求，而经过改造后的菌种产率会大幅度提高。本文论述了诱变育种、代谢调控育种、基因重组育种等菌种改造技术。 关键字：菌种改造；技术 微生物已广泛的应用到医药、卫生、食品、酿酒等各个领域，都取得了很好的效益，而原始的微生物产率都不高，我们必须对其进行菌种改造，才能更好的应用于工业领域中。微生物改造的技术有很多，例如，选择性培养、诱变育种、代谢调控育种和基因重组等[1]。这些技术的应用，促使微生物产率大幅度提高，微生物产品应用越来越广。微生物菌种改造技术涉及微生物学、生物化学、遗传学、分子生物学等多门学科，是一个综合性的应用技术。 1.出发菌株的选择 发酵工业上选用的菌株最初都是从自然界中分离出来的，筛选出优良的菌株是菌种改造的第一步，也是很重要的一步。 菌株的自然选育包括采样、增殖培养、纯种分离、性能测定等[2]步骤。 （1）采样 采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布状况以及菌种的主要特征与外界环境等，进行综合、具体的分析来决定。如果预先不知道微生物的具体来源，一般可从土壤中分离。采样的方法多是在选好的地点，取离地面5～15 cm的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样的时间、地点、环境状况，以备参考。 （2）增殖培养 收集到的样品，如果目标菌株比较多，可直接进行分离并进行增殖培养。而如果目标菌株比较少，则需要对其进行富集培养。提供有利于所需菌株生长而不利于其它菌型生长的条件，使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。例如，生产脂肪酶产生菌时，使用植物油作为唯一碳源，可以更快而准确地分离出产生脂肪酶的菌株。 （3）纯种分离 通过增殖培养还不能得到微生物的纯种，因为生产菌在自然情况下通常与各种菌混杂在一起，所以有必要进行分离纯化，才能获得纯种。分离纯化的方法常选用菌落分离法。把菌种制备成单孢子或单细胞悬浮液，经过适当的稀释后再在平板上进行划线分离。菌种经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。 （4）生产性能的测定 纯种分离后需要对菌株的生产性能做测定，一般使用两步法，即初筛和复筛。而作为育种的出发菌株，这种直接从自然界分离得到的菌株成为野生菌株以区别于人工育种得到的变异菌株。 经过以上四步培养出的菌株即为出发菌株，出发菌株的优劣对于菌种改造有着重要的影响，所以在增殖培养和纯种分离是培养基的选择很重要。我们需要在实验前对目标菌种有充分的了解，根据其特性配制培养基使之更好的和其他菌株分离。 2.诱变育种 （工业菌种基因超级诱变技术的开发与应用研究） 二战期间，由于青霉素高产菌株的急需，人们进行了最早的通过诱变技术筛选性能改进菌种的工作。突变泛指微生物细胞内遗传物质的结构或数量突然发生的可遗传的变化，突变往往导致产生新的等位基因及新的表现型。然而自然条件下基因突变的概率非常低，所以我们采取人工诱变的方式使微生物发生可遗传的变异，然后通过选择作用保留下对我们有益的菌株，完成诱变育种。 2.1诱变剂的类型 （1）物理因素 物理因素有很多包括紫外线、X射线、α射线、β射线、γ射线以及快中子和超声波等。由于紫外线应用最为广泛,效果好，操作方便，我们在此对紫外线诱变做以详细介绍。 一般诱变用15W低功率的紫外灯，这时灯光集中于2537A[1]，是较有效的诱变作用光谱。具体操作方法：在暗室中安装具有稳压装置的15W紫外线灯管，将5mL菌悬液注入直径9cm的培养皿中，放置在离灯管30cm左右的位置，培养皿底要放平，处理前赢先开灯20-30min，预热稳定。照射时启动电磁搅拌装置，以保证照射均匀。一般微生物营养细胞在上述条件下几十秒钟即可死亡，因此要选用适当剂量照射。还应当注意的是，为了避免光复活作用，诱变后应再红光下操作，处理后的菌悬液若需进行增殖培养，也要用黑布包起来。 （2）化学诱变剂 化学诱变剂用量少、设备简单，所以今年来发展较快。但是一般的化学诱变剂都有毒且多为致癌物，所以在使用时应当格外小心谨慎。同一诱变剂对不同微生物或同一微生物不同条件下处理作用效果也不同，因此在设计实验时应认真考虑。我们根据化学因素的作用方式，可以把它分为碱基类似物、引起DNA和核苷酸组成成分变化的化合物和改变DNA结构的化合物三种。 碱基类似物的作用原理是碱基类似物能够代替DNA结构中的四种碱基进入到DNA中去，而又不妨碍DNA的复制，由于他们的化学结构改变了，就有可能引起变异。常用于诱变的碱基类似物有：5-溴尿嘧啶、5-溴脱氧尿核苷、2-氨基嘌呤等。引起DNA和核苷酸组成成分变化的化合物主要是指烷化剂和亚硝酸类物质。烷化剂类的诱变