葡激酶与重组葡激酶的一些研究进展.docVIP

葡激酶与重组葡激酶的一些研究进展 【摘要】葡激酶(Sak)是由某些金黄色葡萄球菌菌株产生的具有活化纤溶酶原溶解血栓作用的蛋白质。。本文综述了葡激酶的结构、基本性质、作用机制和改造葡激酶的方法的一些进展。 【关键词】葡激酶 结构 性质 血栓溶解 重组葡激酶 葡激酶(staphylokinase．Sak)是由某些金黄色葡萄球菌菌株产生的具有活化纤溶酶原作用的蛋白质。早在本世纪四十年代末Lack首先从金黄色葡萄球菌中发现了Sak，五十年代至六十年代就对Sak的纤溶作用进行了体外研究，并在狗的体内评估其溶栓作用，结果发现Sak可导致出血以及毒副作用较大，因而对其研究曾一度沉寂。’近十几年来，国外对Sak的研究仍然方兴未艾．取得了很大进展。1983年，Sako等首先克隆了Sak基因，1985年在大肠杆菌中实现表达，我国中科院上海植物生理研究所于1990年初步克隆了Sak基因，继之其它几家实验室也克隆了Sak基因并在大肠杆菌中获高效表达，有报道其产量是国外的6倍，并利用纯化的重组葡激酶(r—Sak)成功地制备了晶体。 1. Sak的基础研究 1．1 Sak的基因及其蛋白质 Sako等从金黄色葡萄球菌ΦC基因组克隆出Sak基因并确定了其序列。Sak结构基因长489bp，从ATG开始的5’端有27个氨基酸的信号肽序列，起始密码ATG上游7bp处为SD序列(GGAGGG)，上游100bp处富含A—T序列，该区域可能起促进转录作用。终止于序列富含GC，位于终止密码TAA下游300～500bp问。在结构基因的编码区内有一HacⅢ和两相邻近的sau3A位点。 Sak基因编码163个氨基酸残基，由单链多肽构成，其N末端27个氨基酸的信号肽在分泌中被去除，故成熟的Sak由136个氨基酸组成，分子量为1.55～1.8kD，分子内无二硫键，不含胱氨酸。目前已从SakΦC、Sak42D嗜菌体及溶源性金葡菌基因组DNA(SakSTAR)中克隆出三种自然变异的Sak基因，这三种基因编码区中仅有4个核苷酸不同，其中1个不引起氨基酸改变，另3个核苷酸分别影响34、36和43位上的氨基酸。SakΦC在肽链34、36和43位上的氨基酸分别是赖氨酸(Lys)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)；Sak42D分别是赖氨酸、精氧酸(Arg)、精氨酸；SakSTAR则分别为丝氨酸(Ser)、丝氨酸和组氨酸。这三种变异体均通过重组技术成功表达，三种蛋白产物(SakΦC、Sak42D．SakSTAR)具有不同的分子量、电点及热稳定比，但其溶栓效能相同。 在激活纤溶酶原的过程中，随着葡激酶一纤溶酶活性部位的暴露，高分子量葡激酶(HMW-STAR，mature STAR)，在纤溶酶介导下水解末端6个或10个氨基酸成为低分子量葡激酶(LMW-STAR：SakΔ6，Sak△10)，其NH?端分别由原来的Ser-Ser-Ser转变为Gly—Lys—Tyr和Lys—G1y-Asp。低分子葡激酶与高分子葡激酶对纤溶酶原的活化效能相似，研究表明，Sak肽链11位上的赖氨酸和26位上的甲硫氨酸残基是激活纤溶酶原的重要部位，若将其水解或用其它某些氨基酸替代，Sak将失去活性。Sak的二级结构为螺旋状，整个分于由2个大小类似的折叠区域组成，这二部分重心的平均趴离为3.7nm，在溶液中二者相互位置是可变的，象一柔软的易弯曲的哑铃。其旋动半释为2.3nm，斯托克斯半径2.12nm，最大维度10nm，沉降系数1.71S，分子中约18%的氨基酸参与螺旋结构，30%氨基酸参与β片状结构，20%氨基酸参与β转角。 1.2 葡激酶的溶栓机理 Ertkssion等首先提出Sak澈活纤港酶原的机制与SK相同。Sak与纤港酶原按1 ： 1的分子比例形成复合物，导致纤溶酶原话性部位暴露，纤溶酶原由单链变为双链的纤溶酶，形成活性葡激酶-纤溶酶复合物．后者再激活纤溶酶原分子。他们通过电泳证明复合物的存在。如果用话性位点滴定剂NPGB掩盖纤溶酶原上的活性位点．则不能形成有活性的葡激酶-纤溶酶复合物。 但NPGB不能抑制链激酶-纤溶酶复合物的形成，说明连两种酶的激活机制并不相同。Grella等人也证明了Sak与SK的作用机制不同： Sak是一“间接型”纤溶酶原激活物，其本身无生物学功能，它不能直接使纤溶酶原(PLG)转变为纤溶酶(plasmin，PLi)，而是先与纤溶酶原按l：1比例结合形成无活性的复合物PLG—Sak，继之在机体产生的少量纤溶酶启动下，纤溶酶原括性部位暴露，由单链变为双链的纤溶酶，形成活性PLi—Sak复合物，后者进一步激活纤溶酶原分子，使之转变为纤溶酶并进一步溶解血栓。PLG—Sak的激活过程开始速度缓慢，但一旦活性复合物形成，后者可加速其自身