浅析炙马钱子对自身免疫性重症肌无力模型大鼠免疫调节机制.docVIP

　　浅析炙马钱子对自身免疫性重症肌无力模型大鼠免疫调节机制 重症肌无力(myasthenia gravis，MG) 是一种神经-肌肉接头传递障碍的获得性自身免疫性疾病，主要是由血清中乙酰胆碱受体抗体(AChRab)增高和在突触后膜上的沉积导致有效AChR 数目减少而引起的受累肌群无力的症状。目前西医主要有长期的胆碱酯酶抑制剂、激素及免疫抑制剂治疗，静脉注射丙种球蛋白、血浆置换、胸腺切除等疗法。中医则主要以精不足，则补之以味，而形不足，则温之以气为治法进行药物配伍。浙江省中医院将炙马钱子作为院内制剂用于治疗重症肌无力已有三十余年，取得较好的临床疗效，未见明显不良反应。从国内已有的少数报道来看，马钱子治疗MG 有初步疗效。本实验通过对炙马钱子治疗实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠的观察，初步揭示其治疗MG 的免疫调节机制，报道如下。 　　1 实验材料 　　1.1 动物雌性8 周龄的Leg/粒;新斯的明注射液(生产批号11071，上海信谊金朱有限公司，批准文号：，1mg/支;阿托品注射液(生产批浙江瑞新药业股份有限公司，批准文号：，0.5mg/支;强的松片(生产批号120807，浙江仙琚制药股份有限公司，批准文号：，5mg/片，实验时用0.2%的梭甲基纤维素钠将其配制成所需浓度的混悬液。 　　1.3 主要试剂鼠源性乙酰胆碱受体-a 亚基97-116 肽段序列(the rat sequence 97-116 of the AChRa subunit，R97-116)、完全福氏佐剂(CFA)、磷酸缓冲液(PBS)，大鼠IL-6(货号CK-E30646R)、AChRab(货号CK-E30324R)ELISA 检测试剂盒。 　　2 实验方法 　　2.1 EAMG 动物模型建立参考许文华等的R97-116 复制EAMG 实验动物模型。将R97-116、CFA、PBS 三者按1:1.5:1.5 的比例充分混匀制成免疫乳剂;首次免疫：取乳剂200mu;L(含R97-116:100mu;g)于造模鼠足垫、腹部、背部多点皮下注射，正常对照组皮下注射等量PBS;首次免疫后第30 天及第45 天，取乳剂200mu;L(含R97-116:50mu;g)强化接种，A 组注射等量PBS。 　　2.2 EAMG 动物模型评估 　　2.2.1 临床评估通过测量体质量和肌力来评价疾病严重性。①实验前及接种后每周2 次称重，末次免疫2 周后观察其摄食、姿势及活动情况;②测量肌力(即让鼠重复抓握笼顶30s 再测量)采用Lennon 等的分级法予以临床评分，肌力具体分级为：0 级，无肯定的肌无力表现;1 级，撕咬无力，四肢力量差，在光滑地面上前肢打滑，活动减少且容易疲劳;2 级，明显无力，在抓握前就出现震颤、低头、隆背，抓握力弱;3级，在抓握前即有严重的肌无力表现，无力抓握，频死状态;4 级，死亡。症状居中间者分别评分为0.5、1.5、2.5 和3.5 级。 　　2.2.2 新斯的明试验用腹腔注射法给予新斯的明(37.5mu;g/kg)和硫酸阿托品(15mu;g/kg)，12min 后大鼠肌无力症状可缓解，持续2~12h。 　　2.3 实验动物分组及处理从50 只大鼠中随机取8 只作为正常组，其余42 只进行EAMG 造模。在R97-116 免疫大鼠的第2 周末，对实验大鼠进行模型评估，确定建模成功40 只。然后，将这40 只EAMG 成模大鼠随机分为模型组、阳性药物组(强的松组)、炙马钱子低、中、高剂量组，每组8 只。炙马钱子低、中、高剂量组分别以75、150、225mg/(kgd)的剂量(分别按照50kg 成人每日用药为0.6g、1.2g 和1.8g 剂量换算)灌胃治疗，每天1 次;阳性药物对照组以强的松4mg/(kgd)的剂量(按照50kg 成人每日用药30mg 剂量换算)灌胃治疗，每天1 次;正常组、模型组称重后给予药液等量的蒸馏水灌胃，共治疗28 天。实验过程中炙马钱子高剂量组于灌胃后次日死亡2 只大鼠，故最后确定送检标本为5 只，其余各组均6 只。 　　2.4 检测指标及方法各组治疗28 天后，禁食12h;采用眼球取血法取静脉血1.5mL，静置30min后，经3000rpm，离心10min，取上层血清，放置-20℃冷冻保存待测。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法分别检测体液免疫指标乙酰胆碱受体抗体(AChRab)及细胞免疫指标白细胞介素6(IL-6)。 　　2.5 统计学方法应用SPSS17.0 统计软件，实验数据以均数plusmn;标准差(xplusmn;s)表示;对于总体分布不明的小样本资料，各组间结果的比较采用非参数检验，若符合正态分布且方差齐性的则采用单因素方差