ADP-核糖基化因子抑制剂在碱烧伤诱导实验性角膜新生血管中作用的探究.pdfVIP

ADP-核糖基化因子抑制剂在碱烧伤诱导实验性角膜新生血管中作用的研究 中文摘要 ADP-核糖基化因子抑制剂在碱烧伤诱导实验性角膜新 生血管中作用的研究 中文摘要 背景与目的 角膜在正常生理状态下是透明无血管组织，但在感染、机械损伤、化学伤及其 他病理情况下，可以诱导角膜新生血管 (corneal neovascularization, CRNV) 形成， 致角膜失去透明性而引起严重的视力障碍，最终导致失明。因此有效阻止角膜新生 血管的发生是治愈角膜损伤和恢复视力的重要途径。探索和寻找副作用小、抑制角 膜新生血管能力强的方法和手段是眼科学研究的重点和热点课题之一。ADP-核糖 基化因子（ADP-ribosylation factor, ARF ）是囊泡运输中的重要调节因子，属于三 磷酸鸟苷（quanosine triphosphate GTP ）结合蛋白，参与了细胞内物质运输和信号 转导过程。目前关于ARF 的功能研究主要集中于肿瘤方面，认为ARF 蛋白是肿瘤 细胞增殖和代谢的重要调控分子，而其在新生血管性眼病以及 CRNV 中的作用及 其机制的研究国内外报道甚少。因此，本实验从构建碱烧伤诱导CRNV 模型着手， 通过应用ARF 抑制剂腹腔注射法干预实验小鼠以及细胞增殖、迁移体内、体外等 实验手段，探讨ARF 抑制剂在角膜新生血管发生过程中的作用和机制，为临床治 疗CRNV 提供有益的理论依据。 材料与方法 1. 采用浸润1 mol/L NaOH 的2×2 mm 滤纸贴附左眼角膜中央40 s 的方法制作 小鼠角膜碱烧伤诱导CRNV 模型，将36 只BALB/c 小鼠碱烧伤后将其随机分为实 验组及对照组，角膜碱烧伤1 w 后开始，实验组每只小鼠腹腔注射0.5 ml 质量浓度 为0.5 mg/ml ARF 抑制剂溶液，对照组每只小鼠给予腹腔注射0.5 ml PBS 缓冲液， 各自每周3 次，持续1 周。实验组及对照组于造模后2w 分离角膜组织，以CD31 免疫荧光标记法标记新生血管，比较对照组及实验组CRNV 面积。 2. 收集第0 d、4 d 、7 d 以及2 w 小鼠的角膜组织，用Realtime-PCR 法检测角 膜碱烧伤后不同时间点ARF 基因的动态表达。用Western blot 法检测碱烧伤角膜组 I 中文摘要 ADP-核糖基化因子抑制剂在碱烧伤诱导实验性角膜新生血管中作用的研究 织内血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF ）mRNA 的表达情 况。 3. 体外实验应用 ARF 抑制剂干预人视网膜血管内皮细胞（human retinal endothelial cell, HREC ），检测其对细胞增殖、迁移等的影响。 结果 1. 对照组小鼠CRNV 占角膜总面积的比例为0.71±0.20，ARF抑制剂干预组小鼠 CRNV面积为0.53±0.44，两组比较差异有统计学意义（t=3.504 ，P=0.025 ）。 2. 与0 d 比较，碱烧伤后对照组和ARF抑制剂干预组ARF基因水平的表达均有 升高趋势，差异具有统计学意义 （F时间=1229.698, P=0.000 ）。 3. ARF抑制剂干预组VEGF 的蛋白水平表达较对照组同期值明显降低，（t=3.308, P=0.030 ）。 4. 细胞增殖实验结果显示：ARF 抑制剂能明显抑制HREC 细胞系的增殖，并 随药物浓度的升高，抑制效应随之升高的剂量依赖性表现（F=798.222, P 总=0.000 ）。 5. 划痕修复实验结果显示：在12 h 各组HREC 细胞迁移宽度无明显差异。但 在24 h 时间点，100 ng/ml 和1,000 ng/ml 两个浓度的ARF 抑制剂干预组HREC 迁 移宽度分别为6.46±2.32 μm、5.4±1.68 μm，与对照组（8.49±4.18 ）μm 相比明显减 小，差异具有统计学意义(P =0.49, P