Egr-1及骨桥蛋白在大鼠血管平滑肌细胞中的相关性及其机制的研究.pdfVIP

·中文论著摘要· Egr-1与骨桥蛋白在大鼠血管平滑肌细胞中 的相关性及其机制的研究 刖吾 重塑相关性疾病已经愈来愈严重地威胁着人类的健康。目前认为，血管中膜平滑 muscle 肌细胞(smoothcell，SMC)向内膜下迁移与增殖是血管重塑的主要病理 基础之一。 factom，TF)可以调节多个血管平滑肌 研究表明，某些转录因子(transcription smoothmuscle 细胞(vascular cell，VSMC)增殖相关基因的表达，从不同层面调 ECM)在血管重塑过程中的重要地位。研究发现，ECM在各种外界刺激的作用 下，可以作为细胞外信号，经跨膜信号传递系统到达核内，激活一系列调控VSMC 增殖的TF，从而推动VSMC的分裂、迁移及增殖。TF与ECM在血管重塑的过程中 密不可分，因此将二者有机地联系在一起，并对其相互作用关系进行深入探讨， 将有助于全面了解血管重塑的细胞与分子机制。 早期生长反应因子一1(earlygrowthresponse 构TF，参与多种基因的调控，与细胞增殖关系密切。大量研究表明，Egr-1在介 导VSMC迁移、增殖过程中发挥着重要的作用，成为目前血管重塑机制研究中的 为是血管损伤重塑过程中重要的始动因素，应用抗OPN抗体可以抑制VSMC的 表型转化、迁移和增殖。尽管Egr-I和OPN在介导VSMC迁移、增殖过程中均起 着重要的作用，但二者之间的关系尚不清楚。 本课题拟在以往研究的基础上，对培养的大鼠主动脉VSMCs分别稳定转染 相关性。并应用染色质免疫沉淀(chromatin 与OPN启动子的结合情况，同时通过向OPN稳定转染细胞株中加入细胞外信号 调节蛋白激酶(extracellular kinase，ERK)的磷酸化抑制剂，检测 signal-regulated 的内在机制进行深入探讨，并为抑制VSMC的迁移、增殖，控制血管壁的不适当 重塑提供理论及实验基础。 材料与方法 1、大鼠VSMC的培养 bovine 养，用0．25％的胰酶消化、传代。 2、质粒的提纯、扩增及稳定转染 pET-28(．)／NEO质粒被连于CMV启动子上，以便在VSMC中表达。 细胞转染24小时(hour，h)后，加入4001．tg／mlG418的培养液进行培养。2周 G418 后，采用有限稀释法将细胞传至96孔板中进行单克隆化培养(于含2001zg／ml 的条件培养液中)，待长满后进行扩大培养，并检测细胞中Egr-I、OPNmRNA的 —-、● 表达o 3、应用ERK磷酸化抑制剂阻断ERK信号传导通路 当OPN稳定转染的VSMCs生长至80％汇合度时，向细胞培养液中加入10“M ERK磷酸化抑制剂PD98059，继续培养24h后，进行Westernblot检测。 4、反转录多聚酶链反应(reverse chain transcriptasepolymerase 2 reaction，RT-PCR)检测Egr-1、OPNnlItNA 用Trizol PCRKitVer．3．0扩增目的片段。 Reagent提取VSMCs的总RNA。用RNA PCR产物电泳后，用溴化乙啶(ethidium Systems bromide，EB)染色，Biolmaging 系统成像，用NIH 与甘油醛一3一磷酸脱氢酶(glyceralde一3-phosphate 带灰度值的比值分别作为Egr-1、OPNmRNA的相对表达量。 5、We