Egr-1特脱氧核酶下调Egr-1支配的蛋白抑制大鼠颈动脉球囊损伤后的内膜增生.pdfVIP

·中文论著摘要· Egr-1特异脱氧核酶下调Egr-1支配的蛋白抑制大鼠颈 动脉球囊损伤后的内膜增生 -生-笪量 翮吾 intervention，PCI)是目前 经皮冠状动脉介入治疗术(percutaneouscoronary 响了远期疗效。再狭窄的发生是机体对血管内皮损伤的一种修复反应，包括早期 smoothmuscle 的血管弹性回缩和后期的血管平滑肌细胞(vascular cell，VSMC)增 生、迁移，细胞外基质的产生以及血管重塑等。以药物洗脱支架为代表的新医疗 器械的应用，显著降低了PCI术后再狭窄的发病率。然而其远期疗效还有待考证。 近年来随着分子生物学的发展，基因治疗很可能成为防治PCI术后RS的一种新 策略。早期生长反应因子．1(earlygrowthresponsefactor-1，Egr-1)是一种锌指结 factor，TF)，它控制与细胞生长、增殖、分化和凋亡相 构转录因子(transcription 关的多个基因的表达，在外源性刺激(包括生长因子、细胞因子和有害刺激)下 一个具有酶活性的小的单链DNA片段，通过切割特定的RNA链调节蛋白的表达， 作为一种基因抑制剂有着实际的治疗作用。本研究应用合成的Egr-I特异脱氧核 大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响，评估转染ED5后对生长因子、细胞周 期和炎症基因表达变化的影响，探讨其在血管损伤后抑制内膜增生的作用机制。 材料和方法 l、ED5的合成与标记 根据基因库合成ED5(由上海博亚生物技术有限公司合成)，其碱基序列为 代修饰，5端用异硫氰酸荧光素(fluorescein 在荧光显微镜下观察转染后基因的分布情况。两侧下划线所示部分为寡核苷酸识 别序列。 2、动物模型制备和实验分组 96只雄性Wistar大鼠(350．400克)由中国医科大学实验动物中心提供。所 有动物均根据实验室动物护理的原则以及中国动物保护法处理。随机分为4组(每 动脉造成内膜撕脱和血管损伤。具体过程为：10％的水合氯醛麻醉后，颈正中切 开，暴露左颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，用血管夹暂时阻断左颈总动脉和颈 Healthcare 内动脉，用2F导管(美国Bxaetr corporation)从颈外动脉插入向前推进至 主动脉弓，推入生理盐水充盈气囊，沿颈总动脉全长回撤，然后抽瘪气囊。这个 过程重复三次，且每次回撤时导管旋转90度。撤除导管后将200ul含有500pg lmM FuGene6(购自Roche公司)和1 FITC．ED5、转染试剂30．td 70pl MgCl2的溶液 局部注入至损伤的血管节段内，使其在局部作用20分钟。结扎颈外动脉，移除颈 总动脉和颈内动脉的血管夹恢复血流，缝合伤口。术后局部使用青霉素以预防感 染，术后3、7、14、21d分批处死动物。 3、形态分析 HE染色用于形态学测量。颈总动脉用石蜡包埋，然后切成5ttm厚的切片， 并用HE染色，结果用电脑辅助形态分析系统分析，特别注意分析内膜和中膜的 厚度。测量外弹力层包绕的面积(EELA)，内弹力层包绕的面积(1ELA)和管腔 面积(LA)用来评估新生内膜的厚度。其他面积计算如下：中膜面积=EELA-IELA， 新生内膜面积=IELA_LA，内膜中膜面积比(I／M)=新生内膜面积／中膜面积。 4、免疫组化 标本用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，然后制备成5pro厚的切片。然后用二 甲苯和乙醇脱蜡。切片在3％H202孵育10min用来灭活内源性酶的活性。然后切 片在牛血清蛋白(BSA)中孵育20rain以尽量减少非特异性结合的抗体。分别加