PreS1感染决定区随机化HBV库的构建和其感染常用小动物的初步研究.pdfVIP

中文摘要 PreSl感染决定区随机化HBV库的构建 及其感染常用小动物的初步研究 摘 要 乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒，对宿主的特异性要求非常 严格，只能感染与其天然宿主种属关系接近的动物。目前用于研究HBV 感染的动物模型主要有黑猩猩、树嗣、土拔鼠、鸭及各种小鼠模型，但由 于来源困难、价格昂贵、感染效率低、结果稳定性差、繁殖率低、凶猛难 操作、模型制备困难，不能完全重复HBV的整个感染周期等各种原因， 限制了它们的应用。为了弥补上述缺陷，构建新型乙型肝炎动物模型当前 研究HBV的热点及难点。 多年的研究证实，HBV的PreSl区参与病毒感染早期的结合及进入， 决定了宿主的种族及组织特异性。其中有试验指出其主要活性部位最小可 限制在aa5．20序列：基于此原理，本课题采用基因重组技术分别对HBV 感染决定区随机的复制型HBV载体库，并对其感染常用小动物进行初步 研究。本课题由两部分构成。 第一部分PreSl感染决定区随机化HBV库的构建 目的：对HBV 随机化改造，构建PreSl感染决定区随机化HBV库。 方法： 1应用基因重组技术，以pCH．3093为载体，依次构建3种过渡质粒 rand9．17、S1rand12．21、S1 2设计并合成PreSl区的3种随机引物SI rand 16．24及一种3’端与随机引物互补的引物S1 1038(．)。三种随机引物分别 与S11038(．)71物在Klenow Fragment作用下延伸为双链，即可合成随机 片段。 3通过一系列质粒构建，将随机片段插入到野生型HBV相应的PreSl区， 中文摘要 即可构成PreSl感染决定区随机化HBV库。 4检测PreSl感染决定区随机化HBV库的库容、随机性及复制能力。 结果： pCH．3093．Insert，并进行了大小及酶切位点鉴定。 12—21、S1rand rand9—17、S1rand 2合成了PreSl区的3种随机引物S1 16．24及1种与随机引物的3’端互补的引物S1 1038(．)。并成功合成了3 PreSl的相应区域，构 种随机片段，将3种随机片段插入到野生型HBV 建了PreSl感染决定区随机化HBV库。 4通过统计分析证实，三种随机库库容约为10。，氨基酸的实际分布与理 论频数无显著性差异，并扩增获得大量高纯度的随即库质粒。Southern Blotting检测证实，三种随机库的复制能力接近，比野生型HBV弱。 结论：本研究成功构建了3种PreSl感染决定区随机化HBV库 好的随机性。3种随即库的复制能力接近，但比野生型HBV弱。考虑随 即库种的某些碱基影响了病毒的复制能力，但并不影响随即库的应用。这 3种随机库为探索相应HBV动物模型提供了一种便利的试验工具。 第二部分应用Pre$1感染决定区随机化HBV库感染常用小动物 大鼠、BALB／C小鼠、和新西兰小白兔，了解病毒库的感染能力。 方法： cccDNA。 2注射病毒后2个月时，处死动物并分别提取肝组织内的HBV 以所提取的HBVcccDNA为模板，扩增HBVPreSl区的随机序列，将随 机序列插入到野生型HBV的相应部位，构建二代PreSl感染决定区随机 化HBV库，并进行测序。 3应用二代随机库再次注射相应动物，并于1个月和2个月时分别化验血