PYK2在CCR7调控的头颈鳞癌的侵袭及迁移中的作用的研究.pdfVIP

疗的研究提供理论基础。 材料和方法 SCCHN组织标本：60例头颈鳞癌原发灶和颈部淋巴结转移灶样本及10例癌 旁正常口腔黏膜组织样本。患者术前均未接受过任何化学或放射治疗。福尔马林 固定石蜡包埋的肿瘤组织切片常规进行HE染色，分别由两名病理医师诊断，进 11例，临床病理分期显示I—II期28例，III．Ⅳ期32例，伴淋巴结转移30例，无 淋巴结转移30例。 细胞系：人CCR7高表达头颈部鳞癌淋巴结转移细胞系PCI．37B(由匹兹堡 大学肿瘤研究所惠赠)。 免疫组化染色：SP法检测头颈鳞癌无淋巴结转移的原发灶和无转移的淋巴 结，伴淋巴结转移的原发灶和淋巴结转移灶及癌旁正常组织的PYK2蛋白表达情 况。组织切片常规脱蜡并水化。染色步骤简述如下：0．1mol／L Tris—HCI(pHl0．O)缓 冲液，高温高压修复抗原2．5min；3％H202和5％山羊血清37℃下分别孵育切片 复合物37℃分别孵育切片30min；最后DAB显色，苏木素复染细胞核。两名病理 诊断医师分别对组织切片染色情况进行评分。胞浆出现棕黄色颗粒视为阳性细胞。 O％= 至少5个高倍视野下(400×)评价PYK2染色细胞百分比：细胞无染色或染色1 (一)，1 1—50％=(+)，51—75％=(++)，76％=(++十)。 趋化实验：采用Transwell趋化小室法检测。将加入不同处理因素的细胞消 化离心后计数，在趋化小室的下室加600¨l低糖DMEM，内含O．5％BsA及 激的正常细胞为空白对照组，每组3个复孔。24小时后结晶紫染色，随机选取5 个高倍视野计数迁移细胞数。实验重复三次，取平均值。 侵袭实验：在趋化小室的多聚碳酸脂膜上预先铺入1：8稀释的Matrigel基质 胶，4℃风干。趋化小室在孵育箱中作用时问延长至36小时。其他步骤同趋化实 验。 Westemblot实验：对数生长期的细胞饥饿24小时，细胞进行分组处理后， 蛋白。考马斯亮蓝法检测蛋白浓度，上样总蛋白为80pg。sDS．PAGE电泳后转移 酶显法，显色剂显色。ImageJ软件用于半定量分析特异性条带的光密度值，将目 的蛋白与p_actin光密度比值作为相对表达量。实验至少重复3次，取平均值。 免疫荧光实验：PCI．37B细胞经过不同处理后，经过戊二醛固定，透膜和TRITC 标志的鬼笔环肽染色。每步之间PBs冲洗2遍，每次10分钟，最后再用PBs冲洗2 遍后用荧光电子显微镜进行观察。重复上述实验四到五次，以取得最佳结果。 统计学分析：SPSSl3．0统计软件用于数据分析处理。PYK2表达与临床病理因 素的关系用X2检验，DO．05为有统计学意义。其他实验采用t检验，结果用meaIl士 sd表示，pO．05有统计学意义。 实验结果 1、PⅥQ在伴淋巴结转移的头颈鳞癌原发灶及转移灶高表达 通过免疫组化实验，我们检测了PYK2在头颈鳞癌原发灶及淋巴结转移灶和 非转移淋巴结及正常口腔黏膜的表达情况。PYlQ主要表达于肿瘤和淋巴结转移 细胞的细胞质。在伴淋巴结转移的原发灶及淋巴结转移灶中高表达，而在无转移 的原发灶低表达，在正常的口腔黏膜和非转移淋巴结低表达或无表达。统计分析 结果显示：PYK2表达与头颈鳞癌的临床病理分期和淋巴结转移密切相关，而与 患者的年龄及肿瘤大小无关。 2、PYK2的活化与CCLl9诱导的头颈鳞癌淋巴结转移细胞 PCI一37B的趋化和侵袭能力相关 A9和CCR7抗体对PCI．37B细胞进行处理后，通过 应用PYK2抑制剂tyrphostin 趋化实验检测细胞的趋化能力。实验结果显示：与无诱导剂的空白对照组相比， A9和CCR7抗体可 CCLl9诱导可显著增强细胞的趋化能力。PYK2抑制剂ty巾hostin 颈鳞癌细胞的侵袭能力，与对照组比，ccLl9显著增强头颈鳞癌淋巴结转移细胞 A9明显抑制CCLl9诱导的癌细胞的侵袭能力。 PC