SNCG真核表达载体转染胶质瘤细胞及其过表达对紫杉醇耐药性的影响及意义.pdfVIP

±查塑兰： ： SNCG真核表达载体转染胶质瘤细胞及其过表达对紫杉醇耐药性 的影响和意义 摘要 目的：世界卫生组织统计全球每年约有760万人死于癌症，其中恶性 脑胶质瘤的致残率和死亡率显著高于其他肿瘤。尽管采用了最佳的治疗方 案，胶质母细胞瘤患者中位生存期仍只有12至15个月，晚期患者主要死 于对化疗药物耐药而失去对病情的控制。恶性胶质瘤的“明星药”替莫唑 胺，单独使用其治疗复发性和渐进性的胶质母细胞瘤的效果仍不尽如人 意。虽然研究发现在胶质母细胞瘤中确实存在凋亡的机制，但复发性胶质 母细胞瘤即使面对疗效强劲的一线化疗药物紫杉醇的挑战，仍可能缺乏或 隐匿着使细胞继续存活的分子标志物。因此鉴别并找到这种能介导复发性 胶质母细胞瘤细胞存活的分子标志物是非常重要的。而随着对胶质瘤病因 恶性胶质母细胞瘤和间变性室管膜瘤中有着不同寻常的显著高表达，提示 SNCG与在神经胶质瘤的发生及进展有着紧密的关系，甚至在多种恶性肿 瘤中SNCG失去原有组织特异性表现出异常地高表达，并且与肿瘤的增 殖、浸润、转移以及干扰化疗药物等相关，这使得SNCG有望成为新的 肿瘤标志物和抗肿瘤药的作用靶点。而本实验探索旨在将SNCG真核表 持续过度表达SNCG的恶性胶质瘤细胞模型，从基因、细胞周期及药物 干预三个方面，初步探讨稳定高表达SNCG在细胞水平作为协助胶质瘤 存活、增殖分子标志物的可能性，为研究SNCG在胶质瘤细胞中对抗肿 瘤药的药理学作用机制提供客观的实验证据，并为下一步深入探讨SNCG 在胶质瘤中所发挥的作用及动物实验奠定基础。 卡那霉素(amikacin，AMK)50 h，待长出具有AMK阳性抗性菌落后，标记并挑取单个菌落混匀在LB液 体培养基中摇动培养，扩增质粒。按照博迈德质粒小量快速提取试剂盒说 明书提取质粒，以抽提出的质粒为模板行质粒聚合酶链式反应(PCR)以 ：±圭塑墨 ： 扩增鉴定，将SNCG阳性表达的质粒经FuGENEHD试剂转染至人神经胶 首先应用实时定量PCR(Real—timePCR)技术和免疫荧光标记 quantitative 染色法，分别从基因和蛋白水平检测转染后SNCG表达，然后运用CCK．8 法测定紫杉醇对转染SNCG组与实验对照组的增殖抑制情况，并进一步使 用流式细胞术(FCM)检测SNCG对细胞周期的影响。 至人神经胶质瘤细胞U87和U251，并建立稳定转染U87／SNCG细胞系。 荧光显微镜观察U87／SNCG同一视野细胞，可见视野中细胞均呈现绿色荧 mRNA表达量相 光。RT．qPCR检测结果显示，U87／SNCG细胞的SNCG 细胞的SNCG 1／neo细胞 的结果是从紫杉醇诱导12h后开始，SNCG转染组细胞的增殖抑制率相对 较低，与空载质粒对照组存在显著差异P0．05。免疫荧光染色等细胞形态 学观察也证实，随着紫杉醇作用时间的延长，U87／neo细胞数目较 流式细胞术检测提示SNCG的过表达能增强肿瘤细胞的增殖能力，减少紫 杉醇(PTX)所致的肿瘤细胞阻滞于G2／M期，并增强肿瘤细胞的抗凋亡 能力，降低了U87／SNCG细胞凋亡／坏死的比例。 达降低了胶质瘤细胞对PTX的药物敏感性，进一步采用流式细胞术(FCM) 检测胶质瘤细胞周期，初步证实过表达SNCG可降低抗微管药物诱导的 U87细胞有丝分裂期阻滞，增强肿瘤细胞的增殖能力和抗凋亡能力。为我 们后续研究SNCG在胶质瘤中的发生，进展以及浸润、转移中所发挥的作 用奠定基础，以及为胶质瘤的诊断及治疗提供新的思路。而SNCG作为胶 质瘤血清及体液标志物和肿瘤耐药机制的应用价值也可以在I临床上行进 ～步检验，最终可能使其成为控制肿瘤耐药作用的新靶点和抗肿瘤药物研 发作用的新位点。 关键词：神经突触核蛋白吖；神经胶质瘤细胞；稳定转染；实时定量 PCR；流式细胞术；免疫荧光染色 英文摘要