宏基因组结合16srrna数据分析方案116srrna扩增子测序标准.pdfVIP

宏基因组结合16S rRNA 数据分析方案 1. 16S rRNA 扩增子测序标准分析流程 1.1 原始fastq 文件的paired end 双端序列拼接、质量过滤、转化为fasta 文件 1.2 动植物线粒体、叶绿体序列的检测及去除 1.3 嵌合体(chimera)序列的检测及去除 1.4 OTU 聚类 1.5 去除singleton (所有样品中，仅含1 条序列的OTU) 1.6 序列数目标准化(subsample 随机重抽样，按最少序列样品统一每个样品的序 列数目) 1.7 对OTU 代表性序列做物种分类，并统计门、纲、目、科、属的丰度(表格形 式) 。 2. 宏基因组标准分析流程 （MG-RAST 平台） 2.1 序列质量控制 去除paired-end fastq 序列中的低质量序列、人工重复序列。 2.2 识别rRNA 识别rRNA 序列，并鉴定其微生物来源；去除rRNA 序列后，剩下的序列用 于基因预测和功能注释。 2.3 基因预测 预测DNA 序列中编码蛋白质的部分(开放阅读框ORF) 。 2.4 基因注释 在数据库（常用的有KO、COG、SEED subsystems 等，只需选取其中一种 作为功能注释数据库）中比对预测的基因，得到其功能及生物来源信息。 2.5 序列数目统计 统计样本中各类功能、生物来源的序列数目。 2.6 多样本序列数目统计表 将多个样本的序列数目统计表整合到一起（每行为一个功能/生物类别，每 1 列为一个样本，相当于16S rRNA 分析中的OTU 表）。 2.7 序列数目标准化 目的：不同样本的有效序列数目（质量控制后的序列）都不相同，必须对数 据进行标准化才能进行样本之间的比较。 对样本有效序列数目进行标准化（假设最小样本含有 N 条有效序列，在序 列数目统计表中，对序列进行随机重抽样，最终使所有样本的序列数目统一为N 条），得到标准化的多样本序列数目统计表，然后计算某功能在某样本中的相对 丰度A ： A = i/N * 100% 其中i 为该功能在该样本中的有效序列数。 部分功能数据库 （例如KO 、COG、SEED subsystems ）将功能划分为若干 等级（通常是Level 1 、Level 2 、Level 3 、Function 四个级别）的功能类别（Functional Category ），根据标准化的多样本序列数目统计表，可以计算出各个功能类别的 丰度。同理可以计算出各个分类水平下的生物来源丰度。 注：宏基因组的生物来源丰度结果与基于16S rRNA 测序得到的群落丰度数 据并不是一回事。前者反映蛋白质编码序列的生物来源，不能准确反映群落结构。 3.功能结合生物来源分析 （可选步骤） 基于 MG-RAST 平台的宏基因组标准分析得到的蛋白质编码序列生物来源 注释和功能注释是各自独立的。如果想知道特定功能/基因来自哪些生物类群（以 及它们的比例），需要执行以下步骤： 3.1 在样本中筛选出特定功能的序列 3.2 对筛选出的功能序列进行生物来源注释 3.3 特定功能/基因的生物来源丰度表 执行步骤2.5-2.8，得到特定功能类别/基因的生物来源丰度表。 注：步骤3.1 可以筛选任何分类水平的功能，但最终结果只适用于该分类水 平，而不能细分到更低分类水平的功能。以SEED subsystems 数据库Level 1 的 碳水化合物代谢为例（碳水化合物代谢在Level 2 水平可分为CO2 固定、一碳代 谢等若干更细的功能），碳水化合物代谢为筛选条件执行3.1-3.3 的最终结果只能 2 得到碳水化合物代谢的生物来源丰度表，这个表无法告诉我们 CO2 固定、一碳 代谢等功能的生物来源丰度。 4. 个性化分析 4.1 多样性分析 4.1.1 alpha 多样性分析 （适合16S 和宏基因组） 根据标准化的多样本序列数目统计表，计算alpha 多样性指数（例如Shannon 指数、Chao1 丰富度