大鼠颅内外动脉血管平滑肌细胞的体外培养及鉴定.pdfVIP

大鼠颅内外动脉血管平滑肌细胞的体外培养与鉴定 硕士生姓名：郭悦劫 指导教师：李胜教授 专业名称：神经病学 摘 要 extracranial 因，但是近年的研究显示颅内、外动脉粥样硬化(intra-and smoothmuscle 可发生表型转化(phenotypie phenotype)转变为增生态的合成表型(syntheticphenotype)，重新获得向内膜迁 移并增殖的能力。VSMCs的表型转化引发的细胞增殖、迁移、黏附等细胞功能的 变化是动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等血管增生性疾病共同的病理学特征。 因此，VSMCs的体外培养技术为研究其生物学行为以及相关疾病的发病机制及防 治策略提供了一条重要途径。目前颅外动脉VSMCs的培养已经得到广泛应用，但 有关颅内脑动脉VSMCs培养的报道少见，且多取材于牛、猪、犬、兔等动物较粗 大的脑血管。以往报道的酶解离法培养VSMCs因操作繁琐，而限制了其应用。本 研究旨在对原有的酶消化法进行改良，建立大鼠颅内、外脑动脉VSMCs的体外培 养方法，为颅内、外动脉粥样硬化等脑血管疾病机制及治疗的研究提供一个良好 的体外实验模型。 方法：l、VSMCs的原代培养：(1)大鼠脑基底动脉VSMCs：取2只健康雄 性Sprague．Dawley(SD)大鼠(体重250--一300g) ，断颈处死后以75％酒精全身湿 mm的小段， 润消毒。无菌条件下分离大鼠脑基底动脉，去除血管外膜后剪成约0．2 37℃分别用0．1％I型胶原酶消化5h，O．125％胰蛋白酶消化10min。将消化后得到 1．qSD大鼠取仰卧位固定，于颈部正中切一2cm长切口。无菌条件下暴露左侧颈总 动脉，切取长约1．5cm的血管段。将其去除血管外膜及内膜后剪成约0．2mm的小段， 然后按照前述方法行酶消化和培养。2、VSMCs的传代培养：当细胞生长达80％ --90％汇合时，采用0．25％胰蛋白酶消化和传代培养。3、细胞纯化：采用人工刮除 法及差速贴壁法纯化细胞。4、VSMCs鉴定：平滑肌细胞通过观察其形态学及生长 方式来鉴定。舡平滑肌肌动蛋白是分化型VSMCs的特异性标志物，因此同时采用a． 平滑肌肌动蛋白免疫细胞化学方法鉴定。一抗为小鼠抗大鼠小平滑肌肌动蛋白抗体 (1：300)，二抗为生物素化山羊抗小鼠IgG，然后采用SABC试剂盒说明行免疫组 化染色。5、细胞存活率测定：取第5代细胞，采用血球计数器和台盼蓝排斥实验 来计算细胞存活率。 结果：原代培养3d后，来自大鼠基底动脉或颈总动脉的细胞开始贴壁，2周后 细胞呈梭形，汇合后具有平滑肌细胞典型的“峰．谷”样生长特点。传代培养的细 胞保持上述特征，第5代细胞经a．平滑肌肌动蛋白表达鉴定，基底动脉VSMCs和颈 总动脉VSMCs的纯度分别达97％和98％以上。台盼蓝排斥实验检测大鼠基底动脉 VSMCs或颈总动脉VSMCs存活率达95％或96％以上。 结论：这种方法操作简单、结果可靠、成本低廉，可为颅内、外动脉粥样硬 化、再狭窄等脑血管疾病机制和治疗的研究提供适宜的体外培养细胞模型。 关键词：血管平滑肌细胞大鼠颅内动脉颈动脉细胞培养 2 ‘ _ ·-·● l ‘_ _ 1r -一 ln cultureandidentihcationOIVascularSmootamuscle vitro extracranialartel．ieS cellsfrOmratintra．and Master candidate：Guo degree Yuejie