大鼠骨髓基质干细胞及肌腱细胞在体外间接共培养的实验研究.pdfVIP

大鼠骨髓基质干细胞与肌腱细胞在体外 间接共培养的实验研究 硕士生姓名： 王 梓 指导教师： 齐志明 教授 专业名称： 外科学 摘 要 目的 肌腱病的治疗是临床骨科的难点，骨髓基质干细胞的应用为 肌腱病的治疗提供了新思路。骨髓基质干细胞具有多向分化潜能并可以 被诱导分化为多种细胞，但由于骨髓基质干细胞的分化机制及在治疗过 程中的作用方式尚未明确，限制了其在肌腱病治疗中的应用。本课题通 过体外构建骨髓基质干细胞与自体肌腱细胞的间接共培养体系，在单纯 间接共培养环境下与间接共培养同时添加自体富血小板血浆进行干预的 情况下研究间接共培养环境对骨髓基质干细胞的分化诱导作用，以探索 骨髓基质干细胞的分化机制并为骨锈基质干细胞在肌腱病治疗中的应用 提供参考。 方法 应用组织块培养法分离培养大鼠肌腱细胞。体外采集大鼠骨 髓基质干细胞并扩增。采集大鼠血液制备富血小板血浆并激活以获取富 血小板血浆萃取液。利用孔径O．4“m的细胞共培养嵌盒与6孔板构建培 养液相通但细胞不直接接触的间接共培养体系。将生长状态良好的第三 代(P3)大鼠肌腱细胞及第四代大鼠骨髓基质干细胞(P4)用于实验，实验 组骨髓基质干细胞被接种于间接共培养体系外室，将同体肌腱细胞种植 于内室，另外单独设置一组间接共培养组并加入富血小板血浆萃取液。 于间接共培养后第3天、第7天及第10天，分别提取各组间接共培养体 系内外室的细胞进行形态学观察，并利用RT．PCR及免疫组化染色技术 分别对各组肌腱细胞与骨髓基质干细胞的I型胶原与腱调蛋白(TNMD) 进行基因层面与蛋白层面的检测，以分析间接共培养环境对骨髓基质干 细胞分化与细胞外基质表达的影响。 结果 应用组织块培养法成功分离出细胞，并经鉴定证实为肌腱细 胞。应用肌腱细胞与骨髓基质干细胞间接共培养3天后，间接共培养组 的骨髓基质干细胞在RT-PCR检测与免疫组化染色检测中均未表达I型 胶原与腱调蛋白(TNMD)。间接共培养7天后，间接共培养组干细胞在 I型胶原的PCR电泳图像中出现模糊条带，同时I型胶原免疫组化显示 部分细胞呈弱阳性染色，单纯间接共培养组与富血小板血浆干预组之间 结果无显著差异。间接共培养组干细胞在各种检测中未出现对腱调蛋白 (TNMD)的表达。间接共培养l 0天后，间接共培养组干细胞在I型胶原 的PCR电泳图像中出现清晰条带，但亮度低于肌腱细胞对照组。同时I 型胶原免疫组化显示间接共培养组干细胞呈广泛弱阳性染色，通过测定 免疫组化结果的平均光密度进行统计学分析，结果显示间接共培养组骨 髓基质干细胞I型胶原表达量显著高于干细胞阴性对照组，但低于肌腱 细胞对照组。间接共培养组干细胞在腱调蛋白(TNMD)的PCR电泳图像 中表现为模糊条带。但腱调蛋白(TNMD)免疫组化染色结果为阴性。 结论 通过组织块培养法可以在体外成功分离并培养大鼠肌腱细 胞。与肌腱细胞间接共培养的培养环境可以诱导骨髓基质干细胞表达I 型胶原。间接共培养环境下骨髓基质干细胞未出现明显的腱调蛋白表 达。根据实验结果，不能认为富血小板血浆的干预对间接共培养环境诱 导后骨髓基质干细胞细胞外基质的分泌产生影响。尚不能认为间接共培 养环境可以诱导骨髓基质干细胞向肌腱细胞分化。 关键词： 骨髓基质干细胞 肌腱细胞 间接共培养 2 of ratbone Experimentalstudy marrow cellsand indirect tenocytescoculturedinvitro Master Zi degree candidate：Wang Supe