成人原代肝细胞的分离、鉴定及其蛋白质合成及P450表达.pdfVIP

中文摘要 目的：探讨手术切除的成人良性病变肝叶的肝细胞分离及细胞鉴定 技术，研究成人原代肝细胞培养过程中的细胞活力的改变，及蛋白 质合成与细胞色素P450表达的变化。 方法：选择肝脏良性病变的手术切除肝叶标本，采用改良胶原酶灌 注分离法分离肝细胞，用血球计数板计数法对分离后的新鲜肝细胞计 数，台盼蓝拒染法检测新鲜肝细胞活率；利用过碘酸-schiff(PAS) 反应来检测肝细胞的糖原合成能力，并利用免疫组织化学方法来测定 肝细胞角蛋白CKl8的表达联合判断肝细胞纯度；用CCff一8法检测连 续培养7d肝细胞的细胞活力；全自动生化分析仪检测成人原代肝细 胞在培养过程的白蛋白、尿素合成及相关生化功能指标；应用蛋白质 印迹法(WesternBlot)检测体外培养肝细胞细胞色素P450表达(生 物转化反应第一相反应)。 结果： 1．新鲜分离的成人原代肝细胞数目大于109个，台盼蓝拒染法检 测肝细胞活率达90％或以上。 2．培养24小时后，肝细胞PAS糖原染色发现成人原代肝细胞内 糖原被染成红色颗粒或片状，抗细胞角蛋白CK一18免疫组织化学染 色发现CK一18在肝细胞内均匀分布，被染成棕黄色；糖原染色及细 胞角蛋白CK一18联合鉴定肝细胞纯度达95％以上。 3．CCK一8实验结果显示肝细胞培养第三天细胞活力处于最佳状 太 √匕、o 4．培养的1周的过程中，肝细胞均具有良好的合成糖原、白蛋白 万方数据 和尿素的功能。 5．培养过程中，ALT、AST、LDH的泄漏率呈下降后上升的趋势， 在培养3天时达到最低，培养4天时开始上升，白蛋白的分泌量和 尿素合成量在培养3天时达到最高，培养4天时开始下降。 6．在离体培养1—7天中，肝细胞在80KD处均可见有细胞色素 P450表达，并且在第3天表达最好。 结论： 1．改良胶原酶灌注分离法分离肝细胞操作步骤简单，得到的肝细 胞数目多、纯度高且具有完善的细胞功能。 2．本研究所示肝细胞的细胞活力及细胞的生化性质均在培养的 第3天时达到最好的状态。 3．在离体培养l周的过程中，成人原代肝细胞均具有很好的细胞 色素P450表达功能，且在第3天表达最好。 关键词：成人原代肝细胞；鉴定；P450表达 万方数据 i fi cati onandtherotei n i Sof I SOI ati on、ident p synthes aduI t i the i onofP450 express prmaryhepatocyte，and Abstract the isolationandtheidentification explorehepatocyte Objective：To adult lesionsofliverresection of of technologybenign operation the ofcell intheculture of leaves，To viability process studychanges adult the in and