成人原代肝细胞培养和冻存复苏后细胞凋亡的Annexin VPI检测和Fas表达.pdfVIP

摘 要 目ftcJ：研究成人原代肝细胞分离后及冻存复苏后培养过程中肝细 胞凋亡情况，探讨成人原代肝细胞体外长期保存的凋亡特点。 方法：选取手术切除的成人良性病变肝叶标本，采用改良胶原酶 灌注分离法分离肝细胞，加用冻存保护液对肝细胞进行冻存；用血球 计数板计数法对分离后及冻存复苏后的肝细胞进行计数，用台盼蓝拒 染法及流式细胞仪活细胞荧光染色法(FACS)检测肝细胞活力；体 外培养新鲜分离及冻存复苏后的肝细胞，分别在培养的第ld、2d、 3d、5d、7d、9d采用AnnexinV／PI双染色法对肝细胞进行荧光染色， 通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测培养过程中肝细胞凋亡情况； 在新鲜分离的肝细胞体外培养的第1d、2d、3d、5d、7d、9d天，运 用细胞免疫组化技术检测肝细胞Fas表达情况。 结果：1．新鲜分离与冻存复苏后的成人原代肝细胞在形态上无明 显差别；2．采用改良胶原酶灌注分离法分离的肝细胞总数可达109个 以上；3．用胎盘蓝拒染法、流式细胞仪活细胞荧光染色法(FACS) 测定新鲜分离的成人原代肝细胞活率分别为92．7％、93．30％，加用冻 存保护液冻存复苏后的肝细胞活率分别为80．6％、81．24％；4．采用 Annexin V／PI双染色法检测新鲜分离培养的成人原代肝细胞，荧光显 微镜观察细胞凋亡数随培养时间逐渐增多，并且在培养第3天后显著 增加；5．AnnexinV／PI流式细胞分析法检测新鲜分离及冻存复苏后培 养过程中肝细胞的凋亡情况，随时间推移，早期凋亡率及总凋亡率逐 万方数据 渐增高，新鲜分离培养的肝细胞在培养前3天凋亡率增幅不明显(P 培养的肝细胞在培养第2天后凋亡率增幅显著增高(P0．05)；6．细 胞免疫组化检测新鲜分离培养的肝细胞Fas表达显示，在成人原代肝 细胞培养过程中，前3天Fas表达量无显著性差异(PO．05)，在培 养第3天后显著升高(PO．05)。 结论： 1．改良胶原酶灌注分离法分离成人原代肝细胞操作简单、耗时 短，获取的肝细胞数量、纯度及活率高； 2．加用冻存保护液冻存的肝细胞复苏后活率高，长期保存活性较 好； 3．新鲜分离及冻存复苏后的成人原代肝细胞凋亡率在体外培养 的过程中逐渐升高； 4．新鲜分离培养的肝细胞凋亡率及Fas表达在第3天后显著升高， 冻存复苏后培养的肝细胞凋亡率第2天后显著升高，提示在此时间前 培养的肝细胞适合肝细胞移植的临床应用。 关键词：成人原代肝细胞；肝细胞分离；冻存复苏；肝细胞凋亡； Fas表达 II 万方数据 ABSTRACT ofinvitrocultured Objective：Tostudyapoptosis adult primary afteritsisolationand orderto hepatocyte cryopreservation，inthe explore featureofinvitro cultured apoptosis hepatocytes． Methods：Weisolated from livertissueofadult hepatoc