过表达CXC4的骨髓间质干细胞移植治疗大鼠脑梗死的疗效观察.pdfVIP

摘要 过表达CXCR4的骨髓间质干细胞移植治疗大鼠脑梗死的 疗效观察 博士生：俞晓岚 专业：神经病学 导师：张志坚 脑梗死是中老年人致残的主要疾病之一，目前对脑梗死的治疗尚缺乏理想的 方法。在脑缺血损伤模型中，通过动、静脉注射的骨髓问质干细胞(MSCs)都 能够迁移、聚集到损伤部位表明局部缺血微环境可能表达某些信号以促使循环中 的MSCs迁移到该区域。目前，大多数学者倾向于用基质细胞衍生因子．1(SDF一1) 及其唯一特异性受体CXCR4的相互作用来解释这一现象。 SDF．1／CXCR4在骨髓干细胞的动员和归巢、内皮细胞的迁移、血管的发生、 粘附分子表达、移植细胞增殖和存活方面起到重要作用。研究表明组织损伤后， 向损伤组织的趋化聚集，在移植细胞向损伤部位迁移中发挥重要作用。由于 CXCR4在MSCs的表达率比较低，可能影响其向损伤部位迁移。因此我们设想 的表达率能增强MSCs向脑梗死区组织的趋化聚集。 因此本实验构建表达CXCR4的慢病毒载体，并转导rMSCs，采用体内、体 外实验观察过表达CXCR4基因的rMSCs是否具有较高的细胞迁移率，及过表达 CXCR4基因的rMSCs移植治疗脑梗死是否有更好效果。本课题分四部分。 及鉴定 1、材料和方法 1) 根据Genbank大鼠CXCR4编码区序列全长及两端酶切位点需要设计上 下游引物； 2)用RTopCR方法从大鼠肝脏获取a汇R4的cDNA； 3) 段连接，转化，小量抽提质粒DNA，进行双酶切、PCR及测序鉴定。 2、结果 1) 酶切鉴定和测序都证实pNL—CXCR4一IRES2一EGFP质粒构建『F确。 3、结论 EGFP)。 l、材料和方法 1) 细胞，包装生产慢病毒； 2)经超速离心收集病毒颗粒，转导293T细胞，用流式细胞术测定EGFP 蛋白表达率来测定慢病毒功能滴度； 3)用相同滴度的转CXCR4基因慢病毒、空载体慢病毒、CXCR4基因沉 默慢病毒(由本课题组的前期研究所构建)转导rMSCs，建立稳定过 表达CXCR4基因细胞系CXCR4．rMSCs； 4)用RT-PCR、WesternBlot、细胞免疫荧光组织化学和流式细胞术检测转 CXCR4表达情况。 2、结果 细胞，包装产生慢病毒。 3)RT-PCR、Western Blot、细胞免疫荧光组织化学和流式细胞术一致证实 明显被抑制。 3、结论 1) 4 第三部分：SDF—la对rMSCs迁移作用的体外研究 1、材料和方法 1) 体外实验在内置89m孑L径聚碳酸酯膜的48孔微迁移板中进行，趋化因 及siRNA—rMSCs加入到上室，观察细胞迁移情况，计算细胞迁移指数； 2)抗CXCR4多抗阻断后各组rMSCs，观察细胞迁移情况，计算细胞迁移 指数。 2、结果 1)SDF．1a可明显促进rMSCs的跨膜迁移，而且在一定浓度范围随着 SDF．1a浓度梯度增高而增强。 null．rMSCs及siRNA．rMSCs。 阻断前差别有显著性意义；siRNA．rMSCs抗体阻断fj{『与抗体阻断后迁 移指数无显著改变。 3、结论 rMSCs跨膜迁移中起很重要作用。 第四部分：rMSCs静脉移植后的迁移、分化及对脑梗死保护作用的研究 1、材料和方法 天观察以下各指标； 2)体视荧光显微镜下观察EGFP+细胞的分布情况； 3)TTC染色测定脑梗死体积； 4)检测各组大鼠神经功能(mNSS)评分的变化； 5) 免疫荧光组化观察CXCR4表达、神经元、神经胶质细胞及内皮细胞表 面标志观察； 6) 激光扫描共聚焦显微镜观察梗死灶周边区脑J缸流灌注量。 2、结果 1)移植EGFP+rMSC主要存在于大鼠的腑梗死半球大脑皮质、皮质下和 梗死半球特别在缺血半暗带区EGFP+rMSC明显多于其他各组， null—rM