过继传输T淋巴细胞来源exosomes诱导妊娠丢失孕鼠母胎免疫耐受的探究.pdfVIP

中文摘要 耐受的研究 摘 要 目的：反复妊娠丢失是指连续三次或以上发生在孕20周前的妊娠丢 失，是一种严重危害孕妇身心健康的产科疾病。正常妊娠相当于半同种异 体移植过程，孕妇对半同种异体胚胎抗原不产生排斥反而产生保护性免疫 耐受。因此，控制母体对胚胎抗原的免疫反应是介导母胎免疫耐受的重要 手段。 目前临床常采用免疫细胞过继疗法治疗不明原因反复妊娠丢失 (URSA)，诱导受孕母体对半同种异体胚胎抗原的有效免疫耐受。但此种 方法尚存在制备不规范、疗效不稳定等缺陷，限制了临床推广使用。本研 胞成分过继转输对妊娠丢失孕鼠胚胎发育、外周及胎盘局部免疫微环境的 的可行性，为机体免疫耐受的诱导及反复妊娠丢失的免疫治疗研究开辟新 思路。 方法： 雄鼠，无菌解剖取脾，获得单个细胞悬液后与刀豆蛋白A(ConA)共同孵育 值。采用蔗糖密度梯度离心联合超滤技术获得exosomes；扫描、透射电 镜观察exosomes的形态及结构，紫外分光光度法测定蛋白含量。 2建立妊娠丢失动物模型及实验分组：独立饲养未合笼的CBA／J雌鼠为 治疗组(Non．cellular 中文摘要 雄鼠脾T淋巴细胞来源的exosomes)。 3观察胚胎发育情况：将各组CBA／J孕鼠于妊娠第14天分别处死，无菌 条件下解剖胎盘组织，测量后计算胎盘组织体积，将各组吸收胚胎、存活 胚胎分别计数，计算胚胎吸收率及妊娠丢失率。 4检测孕鼠外周T淋巴细胞免疫功能：将各组CBA／J孕鼠于妊娠第14天 分别处死，无菌条件下解剖取脾，制备脾单个细胞悬液。MTT染色法检 测ConA诱导T细胞转化的彳492值：细胞破膜处理，直接荧光标记流式细 IL．4、IL．10的表达。 5分析孕鼠母胎界面免疫抑制状况：各组CBA／J孕鼠于妊娠第14天分别 处死，无菌条件下解剖胎盘组织，制备石蜡包埋切片。HE染色，光镜下 分别以矩形走形计数200个免疫细胞，计算大颗粒淋巴细胞(LGL)、小淋 巴细胞、巨噬细胞(Mop)等各类免疫细胞的百分率。免疫组化染色、图像 示，GS值大小与阳性表达强度反相关；以矩形走形计数200个细胞，分 别计算各组阳性细胞表达百分率。 13．0版本软件检验正态性、方差齐， 6统计学处理：各组数据均通过SPSS 采用卡方检验比较各组孕鼠胚胎发育情况、母胎界面免疫细胞表达情况； 采用F检验对孕鼠T细胞免疫功能、胎盘免疫抑制分子的表达进行单因 素方差分析(ANOVA)，S-N．K法进一步对多个样本均数间进行两两比较。 显著性检验水准a=0．05。 结果： 1雄性无关个体脾脏T淋巴细胞来源Exosomes的初步鉴定 1．1雄性无关个体脾脏淋巴细胞转化情况 光镜下观察雄性无关个体脾脏淋巴细胞转化率为78．250／硅3．50％ 0．249-a：0．073、1．032--L0．064(n=10，P0．01)。 1．2形态及超微结构观察 扫描及透射电镜下观察可见，T细胞来源exosomes为脂质双层膜包 内为低电子密度物质。 中文摘要 1．3蛋白定量 2不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠胚胎发育的影响 相比，细胞及非细胞治疗组胚胎吸收率均显著下降(均P0．01)，且均下降 疗组∽O．05)。 非细胞治疗组分别为20％、16％。与未经治疗的URSA组相比，细胞及非 平(均P0．05)；两治疗组组间比较无明显差异(胗O．05)。 3不同过继转输治疗对妊娠丢失孕鼠外周T细胞免疫功能的影响 3．1检测ConA诱导T淋巴细胞转化功能 间无明显差异(胗O．05)；细胞治疗组、非细胞治疗组较之显著下调(均 P0．05)，且非细胞治疗组显著低于细胞治疗组(尸0．05)。 且非细胞治疗组显著低于细胞治疗组(PO．05)。 3．2检测外周Thl厂r}12细胞功能 3．2．1 Thl型细胞因子的表达 中文摘要 组水平(均P0．05)；两治疗组组间比较无明显统计学意义(PO．05)。 水平(均P0．05)；两治疗组组间比较无明显统计学意义pO．05)。 3．2．2 Th2型细