高效液相色谱串联质谱联用法测定培养基中丝裂霉素C残留量.docVIP

高效液相色谱串联质谱联用法测定培养基中丝裂霉素C残留量 周 菂，谭志荣，卢光琇（中南大学：1生殖与干细胞工程研究所，人类干细胞国家工程研究中心，长沙 410078，临床药理研究所，长沙 410078） 摘 要: 目的　建立液相色谱-电喷雾串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定培养基中丝裂霉素C残留量的方法。 方法　培养基样品经乙腈直接沉淀蛋白后，采用Thermo Hypurity C18柱（2.1 mm (150 mm,5 μ）乙腈=40:60为流动相等度洗脱。通过电喷雾离子源进入质谱，以二级质谱多反应监测（MRM）方式进行检测。结果　丝裂霉素的线性范围分别为0.098～50 ng/ml，最低检测浓度为0.098 ng/ml，平均相对回收率在91.30%～105.46%范围内使用丝裂霉素C（MMC）灭活的鼠胚胎成纤维细胞（mEF）或者人胚胎成纤维细胞（hEF）作为饲养层细胞（feeder cell）来支持人胚胎干细胞（hESCs），是实验室维持人胚胎干细胞不分化的常规培养体系。作为一种DNA损伤试剂，丝裂霉素C可以导致真核细胞染色体核型的改变或者DNA碱基的突变。丝裂霉素C在人胚胎干细胞的培养体系中是否有残留、残留量多少以及残留的丝裂霉素C对人胚胎干细胞的体外培养有何影响尚少见报道。本研究建立了液相色谱-电喷雾串联质谱法（HPLC-MS/MS）测定培养基中丝裂霉素C的残留浓度。通过这种检测手段有助于监控丝裂霉素C的残留量，进一步研究残留的丝裂霉素C对人胚胎干细胞的影响并将丝裂霉素C的残留控制在一个较安全的水平。 1 材料与方法 1.1 仪器 Finnigan LCQ Deca XP型型高效液相色谱仪带自动进样器上海沪西分析仪器厂1.2 试药 甲酸、甲醇和乙腈均为色谱纯（广州迪马公司）；丝裂霉素C（Sigma，USA）；高糖DMEM培养基(Invitrogen, USA)；胎牛血清（Invitrogen, USA）。 1.3方法 1.3.1色谱、质谱条件 色谱柱为Thermo Hypurity C18柱（2.1 mm (150 mm,5 μm）；流动相为乙腈:0.1%甲酸=40:60；流速为0.20 ml/min； 柱温为40 ℃，自动进样瓶温15 ℃。 采用ESI+；毛细管电压: 5.0 kV；源温度: 300 ℃；翘气气体流速: 100 L/h；辅助气体流速: 10 L/h； 采用MRM进行离子方式监测用于监测的离子丝裂霉素质荷比（m/z） 357→274。 1.3.2 对照品储备液 精密称取25.0 mg丝裂霉素对照品，置于10 ml容量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，摇匀，得到液。置于4 ℃冰箱。ml置于1.5 ml Eppendorf离心管管中， 加入乙腈400 μl ,振荡2 min，离心（13 000 r/min）10 min，转移上清液400 μl至2 ml自动进样瓶中，再加400 μl 0.1%甲酸水溶液混匀，进样量10 μl。 1.3.4 专属性实验 取空白培养基0.2 ml, 按1.3.3项操作, 得色谱图；将一定浓度的丝裂霉素C溶液加入空白培养基中,按1.3.3项操作, 得另一色谱图，将2图进行比较。待测物丝裂霉素C的保留时间为1.0 min。 1.3.5　标准曲线和线性范围 用空白培养基将丝裂霉素对照品配制浓度为0.1953.125 ng/ml和25 ng/ml的丝裂霉素对照品培养基各5份，按平行操作得日内精密度（RSD）配制浓度为0.195、3.125和25 ng/ml的丝裂霉RSD）。 1.3.7 萃取回收率 分别取丝裂霉素（0.195、3.125和25 ng/ml）的低、中、高3个浓度的质量控制（QC）样品，按1.3.3项操作，以处理后的色谱峰面积与未经处理直接进样获得的色谱峰面积之比，考察样品的萃取回收率。每一浓度进行5份样本分析。 1.3.8 稳定性考察 待测物经3次冷冻-融溶试验检测稳定性。待测物的培养基溶液室温放置24 h及-40 ℃冷冻保存2月检测稳定性。处理后的样品溶液室温放置24 h检测稳定性。 2 结果 2.1方法专属性 空白培养基色谱图见图1A，丝裂霉素C溶液加入空白培养基的色谱图见图1B。结果表明, 空白培养基中内源性物质及代谢产物不干扰丝裂霉素C。 2.2 质谱特征离子图 丝裂霉素C的特征离子图见图2。 2.3 标准曲线和线性范围 以丝裂霉素对照品与内标浓度比值（y）和对照品与内标面积比值（x）作回归分析，得线性回归方程为：y = 3 600.15＋ 16 837.1*x，r = 0.9905 ，权重为1/x（图3） 2.4 精密度和准确度 日内精密度（RSD）分别为14.31 %、8.69%和5.02%，均小于15%