人TREM-1原核表达载体构建及多克隆抗体制备及急性肺部感染患者可溶性TREM-1检测.pdfVIP

人TlⅧM．1原核表达载体构建和多克隆抗体的制备及 急性肺部感染患者可溶性TREM．1的检测 摘要 【目的】 on cells—l，TREM-1)是一种在炎症 TREM-1(Trigg甜ngrec印toreXpressedmyeloid 反应的触发及放大过程中具有重要作用的分子，选择表达于髓样细胞(如单核／巨噬 细胞、中性粒细胞)表面，可放大促炎性细胞因子的释放，因此它在感染性疾病， 脓毒症等发挥重要作用。感染早期TREM．1可以可溶性形式(solubleTREM．1， sTREM．1)释放进入体液，而且sTREM．1与感染严重程度有较好的相关性，提示 sTREM—l是一种早期诊断急性肺部感染的新指标，为了进一步研究人TREM．1在急 性肺部感染发生发展中的作用，我们构建TREM．1原核表达载体，表达、纯化TREM．1 蛋白；进一步制备多克隆抗体，并对多克隆抗体进行鉴定；建立sTREM．1ELISE检 测方法，并检测急性肺部感染患者血清的TREM．1含量。为急性肺部感染的早期诊 断及疗效评价、预后估计提供新的指标和方法。 【方法】 1．构建含人TREM。1胞外段目的基因的T载体克隆及原核表达载体亚克隆，经 鉴定，将重组基因工程菌扩大诱导表达，亲和层析法纯化诱导的TREM．1融合蛋白。 2．将纯化的蛋白与弗氏完全佐剂乳化，将其作为抗原免疫家兔，获得兔抗人免 疫血清，经硫酸铵盐析纯化，获得初步纯化的兔抗人TREM．1多克隆抗体，通过双 扩散试验和间接ELISE方法检测多克隆抗体的效价和纯度，WeStembolt对它进行 鉴定。 3．用商品单抗和自制多抗建立ELISE夹心法，并对方法进行条件优化，测定其 准确度、精密度、重复性和线性范围，方法建立后用于检测急性肺部感染患者血清 中可溶性TI也M．1的含量。 【结果】 1．成功构建了高表达重组人1rI强M．1蛋白的原核表达载体，并表达具有抗原性的 TREM．1融合蛋白。 2．获得纯化的TREM．1融合蛋白，并用其免疫家兔，得到兔抗人TREM．1多克隆 抗体。以重组蛋白为抗原，用间接ELISE检测n汪M．1抗血清的效价达到l：25600， 双向琼脂免疫扩散试验显示TREM．1多克隆抗体与抗原之间形成单一沉淀线，效价 达蛋白呈现特异性条带，表明所制备的多克隆抗体效价较高，具有良好的纯度。 ELISE检测方法，并对30例急性肺部感染和30例正常体 3．建立可溶性TREM．1 检血清标本进行检测，发现急性肺部感染患者TREM．1含量明显增高。 【结论】 成功构建了高效表达重组人TREM．1融合蛋白的原核表达载体，获得高效稳定 的重组基因大肠杆菌表达菌株，经口TG诱导表达的TREM．1融合具有免疫原性， 将其作为免疫原制备的兔抗人TREM．1多克隆抗体能与纯化的外源性TREM．1融合 蛋白和天然表达的内源性TREM．1蛋白发生结合反应，检测TREM．1多克隆抗体效 价，纯度、活性均达到预期要求。建立ELISE方法检测在急性肺部感染患者血清中 TREM．1明显增高。 【关键词】TREM．1；原核表达载体；多克隆抗体；急性肺部感染；ELISE 2 and f．or Prokaryoticexpressionpolyclonalantibodypreparation of inthe humanTI嗵M．1anddetectionsolubleTREM—l withacuteinf．ection patients lung Abstract 【objec晰e】 on myeloid TREM—