内源性MRI蛋白重链报告基因的体内外成像.pdfVIP

1 IIII IIl lIIi1111 II 11 III ＼1770173 内源性MR]铁蛋白重链报告基因的体内外 成像 硕士研究生：胡秋菊 指导老师：卢光明教授 摘要 背景磁共振(MⅪ)报告基因在示踪基因的表达有着无创、实时、空 间分辨力高等优势，特别是在监测基因治疗、评价细胞分化、干细胞示踪、 评估微环境中的一些特定的代谢物活性等方面有着很大的应用前景。目前的 ]VlT3报告主要包括1)以酶为基础的报告基因，如：B2．半乳糖核苷酶等；2) 以受体为基础的报告基因，其表达和特异的配体结合，可以引起MⅪ信号的 改变；3)以金属蛋白为基础的报告基因，如：酪氨酸激酶，转铁蛋白受体等。 上述报告基因的]VlT3的成像都需要加入外源性的对比剂，这些物质克服生物 屏障，从血液、非特异组织中的清除是当前M甜报告基因成像所面临的巨大 挑战。 铁蛋白是一类普遍存在于动、植物和微生物体内，可以与铁特异性结合 的生物大分子。一般每分子铁蛋白结合约4000个铁离子，形成一种超顺磁性 铁蛋白，引起M对的信号的改变。大量体内外研究表明铁蛋白的表达可以缩 短MRj的I2时间弛豫。由于铁蛋白基报告基因不依赖外源性的对比剂，所 以有很大的优势和广阔的发展前景。本文通过构建小鼠铁蛋白重链质粒并转 染C6胶质瘤细胞，通过体内外的]VIT3成像，探讨铁蛋白作为一种新型内源 性M对报告基因的可行性。 第一部分 小鼠铁蛋白重链基因质粒构建及其转染C6胶质瘤细胞 目的：应用pcDNA3．1(．)质粒载体系统构建携带小鼠铁蛋白重链全基因 质粒，转染大鼠C6胶质瘤细胞，使其高表达，探索铁蛋白基因作为一种新 型内源性磁共振分子影像报告基因的可行性。 方法：从来源于小鼠肌肉的mRNA，根据Genbank中铁蛋白序列设计引 I酶 物，并在引物的5’端分别引入一对含有限制性内切酶NotI和BamH 切位点逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)，扩增出铁蛋白重链全基因(Ftll) 片断。通过限制性内切酶N0tI和BamHI酶切和T4连接酶的作用，将铁 蛋白重链全基因插入到载体pcDNA3．1(．)中，构建铁蛋白重链全基因质粒 pcDNA3．1(．)一F也。构建后经双酶切、测序等鉴定重组质粒。酶切鉴定后， 将重组质粒通过脂质体介导，转染C6大鼠胶质瘤细胞。并通过免疫组化方 式鉴定铁蛋白重链基因在C6胶质瘤细胞内的表达情况及分布。 结果：重组质粒经NotI和BamH I酶双酶切成5．4Kb和5SSbp两个片段， 单酶切成一约6Kb片段，表明成功构建质粒pcDNA3．1(．)一鼬，并经测序结 果证明编码框正确。细胞免疫组化的分析得到铁蛋白重链基因在大鼠C6胶 质瘤细胞内获得表达，表达主要在细胞浆内。 结论：成功构建小鼠铁蛋白重链质粒，并在大鼠胶质瘤C6细胞内表达， 为进一步探讨铁蛋白基因作为一种新型内源性磁共振分子影像报告基因在细 胞示踪和基因显像中的应用奠定了基础。 关键词 铁蛋白重链分子影像报告基因MR／ 第二部分小鼠铁蛋白重链基因的体内、外磁共振成像 目的：应用铁蛋白质粒转染后的大鼠胶质瘤C6细胞，行体内、外的MRI 成像，旨在探讨其作为一种新型MRI内源性报告基因的可行性及显像特点。 方法：将1．5X109铁蛋白重链基因转染成功的大鼠胶质瘤C6细胞与未转染铁 蛋白的大鼠胶质瘤C6制成细胞悬液，行体外细胞群的T2．MAP和T2·．MAP的 MR]扫描，在T2值及T2}伪彩图上测量靠近中央位置的不同体素的12值及T2· 值，比较两细胞的T2、12·值的差异性，统计学方法使用两独立样本的t检验。 并通过普鲁士蓝实验显示细胞内的铁。 注射一次，连