丹红注射液促血管新生作用及其量效关系实验探究.docVIP

丹红注射液促血管新生作用及其量效关系实验探究摘要：目的　探讨丹红注射液的促血管新生作用及其量效关系的可能机制。方法　分别以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)与生理盐水作为阳性及阴性对照，不同浓度丹红注射液作用于鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)后计数一级、二级管，观察其促血管新生作用。不同浓度丹红注射液加入脐静脉血管内皮细胞培养液(HUV)中，以ELISA方法检测培养液中血管内皮生长因子(VEGF)的浓度差别。结果　不同浓度丹红注射液的CAM一级及二级血管新生均较生理盐水组增强，且有量效关系。丹红注射液各组内皮培养液中VEGF浓度均高于生理盐水组，也存在量效关系。结论丹红注射液具有促CAM血管新生的作用且有量效关系，可能的机制为丹红注射液具有促血管内皮分泌VEGF，作用也存在量效关系。 关键词：血管新生；丹红注射液；冠心病；血管内皮生长因子 中图分类号：R541．4 R285．5 文献标识码：A 文章编号：1672―1349(2007)06―0504―03 当前冠心病的血运重建术如冠状动脉支架术及旁路移植术血管新生已普遍应用，效果肯定。但相当数量的病人冠状动脉病变非常弥漫，有些病人无条件或不愿接受血运重建术，冠状动脉的血管新生治疗是极具吸引力的治疗手段，已成为冠心病治疗的热点。现代医学证实血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)具有明确的促进血管新生的作用，已用于冠心病病人的血管新生基因治疗研究，距临床实用尚有较大距离。近年来研究显示中医药在促血管新生领域前景广阔，丹红注射液治疗冠心病疗效确切，具有明确的活血化瘀通络功效。为阐明丹红注射液促血管新生作用的机制，本研究拟应用人脐静脉内皮细胞培养实验，观察丹红注射液促血管内皮细胞分泌VEGF的作用。 1材料与方法 1．1鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型的制备 白皮种蛋购自上海川沙旗杆种禽养殖场。参照贺国安等[1]的“无气室孵育法”加以改进。种蛋在38．5℃60％烘箱中孵育6 d后(倾角45度转蛋防止鸡胚黏连，每天至少2次)用安尔碘、75％乙醇擦拭蛋壳气室端“开窗”部位消毒。待干后，用无菌钻孔器钻取小孔，接着用无菌镊扩大孔径至1cm～1．5cm小窗，使开窗位置在CAM上方，用吸耳球吹净气室中卵壳碎屑，用1mL无菌注射器在气室膜上滴加少许生理盐水分离气室膜和下层的CAM膜，随后用无菌镊将挑破的气室膜分离，充分暴露CAM膜。取事先准备的直径5mm的无菌载体置于CAM膜上两条前卵黄静脉之间相对无血管区，用微量移液器向载体上滴加药物加样。 1．2 CAM实验药液与载体的制备　丹红注射液由济南步长制药有限公司提供，与临床静脉注射用生理盐水按比例配置成1：1，1：2，1：4，l：8无菌液体，4℃下保存备用。阳性对照组用重组牛碱性成纤维细胞生长因子，珠海亿胜生物制药有限公司生产(商品名“贝复济”)。载体用直径为5mm的定性滤纸，118℃高压蒸汽灭菌30min备用。所用苯扎溴铵、安尔碘、甲醇、丙酮、75％乙醇均为分析纯试剂。 1．3 CAM模型分组及实验过程　分别以生理盐水、bFGF为阴性和阳性对照组，丹红注射液与临床静脉注射用生理盐水按比例配置成1：1，1：2，1：4，1：8无菌液体作为药物治疗组，每组样本12个胚胎，每胚加样量为10tLL，加样后，以无菌封口胶封口，置入烘箱中继续孵育。连续加药3 d后制作CAM标本，揭开封口胶，每胚加入2．5 mL～5mL甲醇、丙酮等量混合固定液，室温下固定10min，待CAM上血管内血液凝固后，祛除CAM膜水平以上蛋壳，以载体为中心剪下CAM膜，放人盛有少量清水的平皿中展开，平铺于滤纸上阴干制成CAM标本。用无菌剪照相和扫描处理结果。以实验部位边缘1mm为范围内一级血管，实验部位边缘5mm范围内为二级血管，分别观察计数，比较各组之间的差异。 1．4人脐静脉内皮细胞(HUVEC)实验材料与载体的准备 人脐静脉内皮细胞株购自上海午立生物技术有限公司，试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供，操作严格按说明书进行。用意大利西亚克公司的ALISAI酶免自动分析系统，按药盒说明在792nm处测定A值。胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养液粉末购自美国GIBCO公司。所用其他化学试剂均为分析纯试剂。丹红注射液由济南步长制药有限公司提供，与临床静脉注射用生理盐水按比例配置成1：4，1：8无菌液体，4℃下保存备用。 1．5细胞培养及VEGF测定 将购入的人脐静脉内皮细胞株，用含10％胎牛血清、100U／mL青霉素、50 U／mL链霉素的1640培养液(采用0．22／μm微孔滤膜过滤除菌)在37．5℃、5％CO2浓度的培养箱中培养，每天更换培养液1次。传代中用含0．25％胰蛋白酶、0．25％EDTA(