人白介素—12转基因马铃薯体系外源基因表达遗传稳定性研究.docVIP

人白介素—12转基因马铃薯体系外源基因表达遗传稳定性研究摘要：探讨人白介素-12转基因马铃薯体系外源基因表达的遗传稳定性。方法：将重组质粒用农杆菌介导法转染马铃薯茎段，筛选转基因植株，通过ELISA检测hIL-12在转基因马铃薯中的表达情况。结果经ELISA检测茎和叶中hIL-12的表达量，其中2株与对照组相比有显著性差异（P关键词：人白细胞介素12；遗传稳定性；马铃薯 中图分类号：G633.91 人白细胞介素-12（human interleukin 12， hIL-12）是由单核细胞、巨噬细胞分泌表达的一种细胞因子，具有广泛的生物学活性，它能促进NK细胞和T细胞的增殖、活化及细胞毒作用，促进巨噬细胞的活化，并诱导多种细胞因子的产生，调节Th0细胞向Th1细胞分化增殖，增强细胞免疫功能[1-2]。本文利用基因重组技术，构建人白介素-12基因的植物表达载体，将hIL-12基因导入马铃薯，获取转基因马铃薯植株，探索人白介素-12转基因马铃薯体系外源基因表达的遗传稳定性，现报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要材料 质粒pCA13-hIL-12由中科院遗传发育研究所提供；pBI121由浙江大学提供；根癌农杆菌EHA105以及辅助质粒pRK2013由中国科学院植物研究所提供；菌株DH5α购于上海生工生物工程公司。hIL-12基因引物按基因库中cDNA序列设计，两端分别加上SmaⅠ和SacⅠ酶切位点，由上海生物工程公司合成。引物序列见下：①上游引物 5-TCC CCC GGG CCA CCA TGG GTC ACC AGC A-3’，下游引物 5-A CCG GAG CTC TTA GGA AGC ATT CAG ATA G-3’。细胞株COS-7购自中科院遗传发育研究所，马铃薯试管苗（中薯1号），由本实验室传代培养。 1.2 马铃薯体系外源基因表达体系的建立 1.2.1 马铃薯试管苗的培育 选择粗壮的试管苗，无菌下切成带一叶一节的接种于MS生长培养基上，温度25℃，光照14h/d，光强2000lx培养。 1.2.2 转化 平板上分别挑出三亲杂交转化后的根癌农杆菌EHA105单个菌落，接种在三抗LB液体培养基中28℃，过夜培养，4℃ 5000rpm离心10min，菌体重悬于MS0中，使OD600调整为0.5；无菌状态下，将培育好的马铃薯试管苗，剪下茎段在上述菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干表面菌液，转入表面铺有一层滤纸的愈伤组织诱导培养基上，于28℃暗培养3d后，转到抗性愈伤组织诱导培养基上，25℃光照16h/d，光强2000lx培养，诱导抗性愈伤组织，10-15d后，伤口部位出现微小的愈伤组织，将愈伤组织连同外植体一起转移到芽分化培养基上，20-25d后分化出小芽，每两周更换一次培养基。 1.2.3 转化体的筛选 待芽分化培养基上的芽长至2-3cm高时，切下转至无激素的生根培养基上继代培养，进行生根筛选，将在抗性培养基上生根的马铃薯植株切成带有2-3个节的茎段，接种在MS高糖培养基上，暗处诱导试管苗结薯。观察组：马铃薯试管苗，剪下茎段在三亲杂交转化后的根癌农杆菌EHA105菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干表面菌液。对照组：马铃薯试管苗，剪下茎段在未进行三亲杂交转化后的根癌农杆菌EHA105菌液中浸泡5min，用无菌滤纸吸干表面菌液。 1.3 遗传稳定性分析 用双抗体夹心ELISA方法检测转基因马铃薯中hIL-12蛋白表达量，按试剂盒说明书完成。 1.4 统计学处理 所有数据用SPSS（11.5版本）统计软件进行统计学分析，结果用 ±S表示，P2 结果 51、80号马铃薯茎和叶的蛋白提取液中hIL-12的表达量分别为2228.4±29.3和2078.9±111.0pg/ml，与对照组对比差异明显（P表1：ELISA检测转基因马铃薯茎和叶中hIL-12的表达水平 组别 hIL-12表达量（pg/ml） 对照组 1083.5±103.5 51号 2228.4±29.3 80号 2078.9±111.0 F 16.323 P 0.000 3 讨论 近几年来，随着植物基因工程及生物技术的飞速发展，1992年，Mason[3]等提出了利用植物作生物反应器生产口服疫苗的设想。马铃薯这一世界性的粮食和蔬菜作物，被众多研究者认为是较理想的植物材料之一[3-4]。 用马铃薯作为生物反应器因其具有生长容易，产量大；遗传转化体系比较完善，转化周期短，可以通过无性繁殖快繁获得的基因转化植株；小鼠可以直接生食块茎，有利于动物免疫实验等特点，而倍受科学工作者的青睐。本实验室已建立了马铃薯试管苗通过茎段进行快速繁殖的方法，且有学者都用茎段作为外植体浸苗取得了成功，故选用马铃薯茎段作为浸染的外植体。实验采用农杆菌EHA105生长至对数长期的菌液冲释5～10倍，