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人神经营养素-3基因修饰神经干细胞[摘要] 目的：探讨移植表达人神经营养素-3（human neurotrophin-3，hNT-3）基因的神经干细胞（neural stem cells， NSCs）对缺血性脑损伤大鼠海马区内源性NSCs的增殖、分化的影响。方法：建立大鼠缺血再灌注脑损伤模型，在术后第7天将转染hNT3基因的神经干细胞（NSCs- hNT3），移植到大鼠纹状体半暗带。对照组移植普通NSCs或生理盐水。然后腹腔注射BrdU对新增殖的细胞进行标记，再行免疫荧光双标染色对NSCs的增殖及分化进行检测。结果：与对照组比较，NSCs-hNT3移植后，能显著增加大鼠缺血侧海马齿状回（denate gyrus， DG）BrdU+细胞数（P=0.037，P=0.004， respectively），其中90%以上为BrdU与DCX染色双阳性（BrdU+/DCX+）的未成熟神经元。且与生理盐水组比较，普通NSCs移植后，缺血侧海马DG区BrdU+/DCX+细胞数也显著增加（P=0.004）。结论：NSCs移植对大鼠缺血侧海马DG区内源性NSCs增殖有促进作用，新增殖的细胞主要向神经元方向分化；经hNT-3基因修饰， NSCs的治疗作用得以加强，并有助于神经功能的改善。 [关键词] 神经干细胞；慢病毒载体；转基因；神经营养素-3；脑缺血 应用干细胞移植技术来治疗中风等神经系统疾病的基础研究已取得一定进展。但到目前为止，还没有直接证据表明移植细胞能和宿主的神经网络建立有功能的突触联系[1]。近年来，研究方向已转向促进中枢神经系统（central nervous system， CNS）内源性NSCs的增殖、存活及向神经元方向分化[1]。本研究旨在进一步探讨细胞移植后对大鼠海马区内源性细胞增殖及向神经元方向的分化的影响。 1材料和方法 1.1 实验动物及器械 孕14天Sprague-Dawley大鼠1只及雄性Sprague-Dawley大鼠（体重230g～250g）由汕头大学医院实验动物中心提供。15ml离心管（Corning，Mexico）， 低温离心机（Lock-Song，北京路科顺高新技术有限公司），一次性200目尼龙细胞筛（BD Falcon，美国），24孔培养板（Corning，美国）， 25cm2细胞培养瓶（Corning，美国），CO2恒温培养箱（Thermo forma 3110 series， 美国），倒置荧光显微镜（Leica，德国），手术显微镜（Leica，德国），立体定向仪（江湾II型-C）。 1.2 实验试剂 干细胞培养液：DMEM/F12培养液（Gibco，美国），添加b-FGF（20ng/ml，Cytolab/Peprotech Asia，美国）、EGF 20ng/ml，Cytolab/Peprotech Asia，美国），1%浓度的N2和2%浓度的B27添加剂（Invitrogen，美国），谷氨酰胺（2mmol/ml，Hyclone， 美国）、青霉素（10u/ml， Gibco ，美国）、链霉素（10mg/ml， Gibco ，美国）。4℃保存。0.25%胰蛋白酶（Gibco ，美国），胎牛血清（Invitrogen，美国）； 10%水合氯醛（Sigma-Aldrich） ； 表达hNT3基因的慢病毒载体（LV/ hNT-3，上海吉凯基因化学技术有限公司构建）。 1.3 神经干细胞分离、培养及hNT-3基因修饰 从孕14天Sprague-Dawley胎鼠海马组织提取NSCs，进行体外无血清培养、扩增和纯化 [2]。经免疫荧光Nestin染色鉴定后，取第五代的神经干细胞球，用0.125%的胰蛋白酶消化和机械吹打的方法，使神经球分散成3～5个细胞一簇；4℃离心1000rpm×5min，吸走上清，再用干细胞培养液洗涤细胞两次；用干细胞培养液重悬细胞，以1×105 cells /500micro;l/孔接种于24孔板，置37℃，5%CO2培养箱中培养；3～4h后，各孔以最佳感染复数 （multiplicity of infection， MOI）为10的比例加入LV/ hNT-3稀释液100micro;l， 10h后置换出病毒液，培养条件不变。已转染hNT-3基因的NSCs命名为NSCs-hNT3。 1.4 大鼠缺血再灌注模型（tMCAO）建立及细胞移植 参考Pringle等的方法，建立大鼠tMCAO模型[3]，右侧大脑中动脉阻断时间为2h。tMCAO模型建立后7d，选取神经损害程度评分[4] （Neurological Severity Scores，NSS）为8～9分的大鼠，随机分为NSCs-hNT3治疗组、NSCs治疗组及生理盐水对照组，各